某動(dòng)物體內(nèi)含有研究者感興趣的目的基因，研究者欲將該基因?qū)氪竽c桿菌的質(zhì)粒中保存。該質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、LacZ基因及一些酶切位點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)和簡(jiǎn)單的操作步驟如圖所示?；卮鹣铝袉?wèn)題：

（1）制備重組質(zhì)粒常用同種限制酶的原因是能產(chǎn)生

產(chǎn)生相同的粘性末端

產(chǎn)生相同的粘性末端

。為了使質(zhì)粒DNA與目的基因能連接形成重組質(zhì)粒，還需要在混合物中加

DNA連接酶

DNA連接酶

。
（2）培養(yǎng)基中除了加入大腸桿菌所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還需要添加

X-gal、氨芐青霉素

X-gal、氨芐青霉素

以便篩選導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌。
（3）為了使大腸桿菌處于一種能

能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子

能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子

的生理狀態(tài)，一般先用Ca²⁺處理大腸桿菌細(xì)胞。
（4）將質(zhì)粒和目的基因的混合物與上述處理后的大腸桿菌混勻，制備轉(zhuǎn)基因大腸桿菌，取0.1ml上述溶液采用

稀釋涂布平板

稀釋涂布平板

法接種于培養(yǎng)基表面，在37℃下倒置培養(yǎng)16 h。經(jīng)培養(yǎng)后，分別統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)目的基因大腸桿菌的菌落數(shù)和總菌落數(shù)，并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。理論上轉(zhuǎn)目的基因受體菌的菌落呈現(xiàn)

白

白

色，原因是

帶有目的基因質(zhì)粒的大腸桿菌便不能表達(dá)β-半乳糖苷酶，培養(yǎng)基中的X-gal不會(huì)被水解成藍(lán)色，大腸桿菌將形成白色菌落

帶有目的基因質(zhì)粒的大腸桿菌便不能表達(dá)β-半乳糖苷酶，培養(yǎng)基中的X-gal不會(huì)被水解成藍(lán)色，大腸桿菌將形成白色菌落

。實(shí)驗(yàn)中實(shí)際轉(zhuǎn)化效率介于50%～85.7%，原因是

插入基因和質(zhì)粒的濃度、限制酶和連接酶的活性、反應(yīng)時(shí)間；重組質(zhì)粒的濃度、受體菌的狀態(tài)和密度、轉(zhuǎn)化時(shí)間等

插入基因和質(zhì)粒的濃度、限制酶和連接酶的活性、反應(yīng)時(shí)間；重組質(zhì)粒的濃度、受體菌的狀態(tài)和密度、轉(zhuǎn)化時(shí)間等

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