一種天然蛋白t-PA能高效降解因血漿纖維蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和腦血栓的急救藥，但是心梗患者注射大劑量的t-PA會(huì)誘發(fā)顱內(nèi)出血。研究證實(shí)，將t-PA蛋白第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，能顯著降低其誘發(fā)出血的副作用。據(jù)此，先對(duì)天然t-PA基因的堿基序列進(jìn)行改造，然后再采取傳統(tǒng)的基因工程方法表達(dá)該改造后的基因，可制造出性能優(yōu)異的改良t-PA蛋白。如圖表示相關(guān)的目的基因、載體及限制酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，pCLY11為質(zhì)粒，請(qǐng)回答下列問題：

（1）可以先提取細(xì)胞的

mRNA

mRNA

來合成總cDNA，再?gòu)腸DNA文庫(kù)中獲取t-PA基因。通過改造t-PA基因制造出性能優(yōu)異的改良t-PA蛋白的過程被稱為

蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)

工程。
（2）若改造后的t-PA基因的黏性末端如上圖所示，則需要選用限制酶

XmaⅠ和BglⅡ

XmaⅠ和BglⅡ

切割質(zhì)粒pCLY11，保證質(zhì)粒與t-PA改良基因高效連接。再用DNA連接酶催化形成

磷酸二酯

磷酸二酯

鍵，構(gòu)建重組質(zhì)粒。
（3）以大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在含新霉素的培養(yǎng)基中形成菌落的受體細(xì)胞并非都是目的菌株，原因是

導(dǎo)入未連目的基因的質(zhì)粒的大腸桿菌也可以在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

導(dǎo)入未連目的基因的質(zhì)粒的大腸桿菌也可以在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

。成功獲取能生產(chǎn)改良t-PA蛋白的工程菌株后，利用

液體

液體

（填“固體”或“液體”）培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中進(jìn)行大量生產(chǎn)。
（4）除了用工程菌株，還可以用下列方法從轉(zhuǎn)基因牛乳汁中獲得改良t-PA蛋白：

過程②常用的方法是

顯微注射法

顯微注射法

；在過程④前需要取囊胚的

滋養(yǎng)層

滋養(yǎng)層

細(xì)胞做DNA分析進(jìn)行性別鑒定；為了保證t-PA改良基因能在乳腺細(xì)胞中表達(dá)，構(gòu)建基因表達(dá)載體需要將其與

乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子

乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子

等調(diào)控元件重組在一起。