為了研究低溫誘導(dǎo)對(duì)某基因的啟動(dòng)子P活性的影響，科研人員進(jìn)行了啟動(dòng)子P的PCR 提取、特定表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因煙草的功能鑒定。該基因及其啟動(dòng)子P 的結(jié)構(gòu)及相應(yīng)限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示，圖中淺灰色區(qū)域堿基序列是已知的，啟動(dòng)子P（圖中深灰色區(qū)域）及上游堿基序列未知，片段Ⅰ和片段Ⅱ中的字母A～F均表示引物。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。
（1）啟動(dòng)子是

RNA聚合酶

RNA聚合酶

識(shí)別和結(jié)合的部位。不能直接根據(jù)片段Ⅰ擴(kuò)增啟動(dòng)子P的原因是

啟動(dòng)子P及上游的序列未知，無(wú)法合成PCR所需要的引物

啟動(dòng)子P及上游的序列未知，無(wú)法合成PCR所需要的引物

。
（2）為了能擴(kuò)增正常啟動(dòng)子P，科研人員先用

酶1和DNA連接

酶1和DNA連接

酶處理圖中的片段Ⅰ，使片段Ⅰ成為環(huán)狀DNA；再將環(huán)狀DNA 用

2

2

酶處理得到了片段Ⅱ，如圖所示。
根據(jù)片段Ⅱ，用

D和E

D和E

引物組合（用C、D、E、F表示）能擴(kuò)增出啟動(dòng)子P。
（3）已知卡那霉素可抑制煙草細(xì)胞的生長(zhǎng)，基因M可在煙草的根部正常表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物 可將X-Gluc水解生成藍(lán)色物質(zhì)。將啟動(dòng)子P和基因M結(jié)合并與含有卡那霉素抗性基因的Ti-質(zhì)粒重組構(gòu)建基因表達(dá)載體。將表達(dá)載體加入含有煙草細(xì)胞的培養(yǎng)基中，篩選出所需的煙草細(xì)胞，然后經(jīng)過(guò)培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。將上述轉(zhuǎn)基因煙草植株分為A、B兩組，A組在常溫（25℃，對(duì)照組）下培養(yǎng)，B組在低溫（4℃，實(shí)驗(yàn)組）下培養(yǎng)，一段時(shí)間后取A、B的幼根，浸入適量

X-Gluc

X-Gluc

溶液中，觀察煙草細(xì)胞中基因M的表達(dá)情況（表達(dá)強(qiáng)度越大，細(xì)胞表現(xiàn)的藍(lán)色越深）。若A、B組的結(jié)果分別為

A藍(lán)色較深、B藍(lán)色較淺

A藍(lán)色較深、B藍(lán)色較淺

，則說(shuō)明低溫抑制啟動(dòng)子P的功能。