針對(duì)新冠病毒（SARS-CoV-2）的重組蛋白疫苗、核酸疫苗（包括 DNA 疫苗和RNA 疫苗）等疫苗都在研發(fā)當(dāng)中。下圖為其中一種疫苗的研發(fā)思路，圖中①～⑦表示過(guò)程，虛線箭頭表示 NcoⅠ、SphⅠ、NheI、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)（四種酶的識(shí)別序列詳見(jiàn)表），標(biāo)記基因 SUC2 控制合成蔗糖酶，使 P 型酵母菌能利用培養(yǎng)基中的蔗糖生存。
| 限制酶 | NcoⅠ | SphⅠ | NheⅠ | BamHⅠ |
| 識(shí)別序列和切割位點(diǎn) | C↓CATGG | CCATC↓C | C↓CATCC | C↓CTACC |
逆轉(zhuǎn)錄酶
逆轉(zhuǎn)錄酶
酶先得到 cDNA，再使用PCR 技術(shù)擴(kuò)增得到S 基因。（2）為使③過(guò)程順利進(jìn)行，需使用限制酶
NcoⅠ、NheⅠ
NcoⅠ、NheⅠ
切割質(zhì)粒B。（3）圖中表示篩選的過(guò)程是
⑤
⑤
（填編號(hào)），為達(dá)到利用標(biāo)記基因篩選的目的，普通的P 型酵母菌應(yīng)該滿足的代謝特點(diǎn)是 不能利用蔗糖
不能利用蔗糖
。（4）重組疫苗注入志愿者體內(nèi)后，S 蛋白基因指導(dǎo)合成的 S 蛋白作為
抗原
抗原
，刺激機(jī)體產(chǎn)生能與之相結(jié)合的抗體，抗體的分泌量可作為檢測(cè)疫苗對(duì)志愿者免疫效果的指標(biāo)。參加臨床試驗(yàn)的志愿者需要滿足的條件之一是 無(wú)
無(wú)
（填“有”或“無(wú)”）SARS-CoV-2 感染史，理由是 有SARS-CoV-2感染史的志愿者血清中會(huì)存在一定量相應(yīng)抗體，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾
有SARS-CoV-2感染史的志愿者血清中會(huì)存在一定量相應(yīng)抗體，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾
。（5）新型冠狀病毒感染的常規(guī)檢測(cè)方法是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光 PCR 鑒定。實(shí)時(shí)熒光 PCR 擴(kuò)增目的基因，需額外添加熒光標(biāo)記探針（一小段單鏈 DNA，可與目的基因中部序列特異性結(jié)合）。當(dāng)探針完整時(shí)，不產(chǎn)生熒光。在PCR 過(guò)程中，與目的基因結(jié)合的探針被TaqDNA 聚合酶水解，R 與 Q 分離后，R 發(fā)出的熒光可被檢測(cè)到（如圖甲），通過(guò)實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)新型冠狀病毒感染時(shí)，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度變化如圖乙。
①與指數(shù)增長(zhǎng)期相比，線性增長(zhǎng)期目的基因數(shù)量的增長(zhǎng)率下降，原因有
TaqDNA聚合酶活性下降、引物濃度下降、原料dNTP濃度下降
TaqDNA聚合酶活性下降、引物濃度下降、原料dNTP濃度下降
。②Ct 值的含義：在PCR 擴(kuò)增過(guò)程中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。因此，當(dāng)樣本中初始模板越多時(shí)，Ct 值就
越小
越小
。③某新型冠狀病毒核酸檢測(cè)說(shuō)明書標(biāo)明，Ct≤37 判定為陽(yáng)性，Ct＞40 或無(wú)Ct 值判定為陰性。圖乙所示新型冠狀病毒核酸檢測(cè)結(jié)果應(yīng)判定為
陽(yáng)性
陽(yáng)性
。④陰性結(jié)果也不能排除新型冠狀病毒感染?？赡墚a(chǎn)生假陰性的因素有
abc
abc
。a.取樣太早，樣本中病毒量少，達(dá)不到實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)閾值
b.樣本被污染，RNA 酶將病毒 RNA 降解??????????????
c.病毒發(fā)生變異
【考點(diǎn)】基因工程在農(nóng)牧、醫(yī)療、食品等方面的應(yīng)用．
【答案】逆轉(zhuǎn)錄酶；NcoⅠ、NheⅠ；⑤；不能利用蔗糖；抗原；無(wú)；有SARS-CoV-2感染史的志愿者血清中會(huì)存在一定量相應(yīng)抗體，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾；TaqDNA聚合酶活性下降、引物濃度下降、原料dNTP濃度下降；越??；陽(yáng)性；abc
【解答】
【點(diǎn)評(píng)】
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發(fā)布：2024/4/20 14:35:0組卷：57引用：1難度：0.7
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1．人類基因組計(jì)劃測(cè)定了人體的24條染色體，這24條染色體是（ ?。?/h2>
發(fā)布：2024/12/31 0:30:1組卷：112引用：7難度：0.7 -
2．學(xué)習(xí)以下材料，回答（1）～（4）題。
利用抑制性tRNA進(jìn)行無(wú)義突變遺傳病的治療
無(wú)義突變是由于某個(gè)堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子（UAA、UAG或UGA），從而使肽鏈合成提前終止，造成蛋白質(zhì)的功能改變，引發(fā)相關(guān)疾病。約有10%～15%的人類基因相關(guān)遺傳疾病是由無(wú)義突變引發(fā)的。常規(guī)的基因治療是將正常基因的cDNA序列或是有治療價(jià)值的基因（如CRISPR-Cas9相關(guān)的基因編輯工具）通過(guò)一定的方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到替代或修復(fù)缺陷基因、治療疾病的目的。導(dǎo)入基因插入位置不當(dāng)、過(guò)高或過(guò)低表達(dá)，都可能會(huì)導(dǎo)致副作用。盡管基因編輯可以實(shí)現(xiàn)生理水平的基因表達(dá)，但基因編輯工具引入外源蛋白可能引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)仍然是巨大的挑戰(zhàn)。
抑制性tRNA（sup-tRNA）由天然tRNA改造而來(lái)，它的反密碼子通過(guò)堿基配對(duì)原則可以識(shí)別無(wú)義突變的終止密碼子，使得mRNA在翻譯至無(wú)義突變位點(diǎn)時(shí)不啟動(dòng)翻譯終止而是繼續(xù)向后進(jìn)行翻譯，獲得有功能的全長(zhǎng)蛋白。
I型黏多糖貯積癥的病因，是相關(guān)基因發(fā)生無(wú)義突變，產(chǎn)生終止密碼子UAG。研究者構(gòu)建小鼠該突變基因mldua和Flag基因融合的載體（圖1），以及針對(duì)該無(wú)義突變?cè)O(shè)計(jì)的sup-tRNA表達(dá)載體（產(chǎn)生的sup-tRNA能夠識(shí)別UAG并攜帶酪氨酸Tyr,簡(jiǎn)寫作sup-tRNATyr），將其導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與具有相似作用的化合物G418比較，sup--tRNA的作用更加顯著（圖2）；進(jìn)一步利用重組腺相關(guān)病毒作為載體將sup-tRNA導(dǎo)入患病小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)顯示能夠降低黏多糖過(guò)度積存，實(shí)現(xiàn)對(duì)該病癥的有效治療，其療效可以持續(xù)半年以上。
從整體來(lái)看，G418在促進(jìn)跨越無(wú)義突變位點(diǎn)繼續(xù)翻譯時(shí)引入的氨基酸較為隨機(jī)，而sup-tRNA引入的氨基酸較為單一，且不會(huì)影響內(nèi)源tRNA穩(wěn)態(tài)，所以sup-tRNA在個(gè)體治療中具有很高的安全性，因而在未來(lái)基因突變引起的疾病相關(guān)治療中具有非常大的應(yīng)用前景。
（1）侵染時(shí)，作為載體的重組腺相關(guān)病毒與靶細(xì)胞膜上的發(fā)生識(shí)別，引發(fā)內(nèi)吞，進(jìn)入細(xì)胞后釋放單鏈DNA作為模板，利用宿主細(xì)胞的催化合成其互補(bǔ)DNA鏈，再經(jīng)過(guò)過(guò)程產(chǎn)生sup-tRNA。
（2）除了引入的氨基酸較為單一，不影響內(nèi)源tRNA穩(wěn)態(tài)，我們還可推斷，用于治療的sup-tRNA在正常終止密碼子處（填“能”或“不能”）繼續(xù)往后翻譯，具有很高的安全性。
（3）研究者構(gòu)建mldua突變基因和Flag基因融合的載體，目的是通過(guò)檢測(cè)來(lái)確定是否跨越無(wú)義突變位點(diǎn)繼續(xù)向后翻譯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于化合物G418，sup-tRNA在促進(jìn)無(wú)義突變位點(diǎn)的翻譯方面更加有效，支持這一結(jié)論的依據(jù)是：。
（4）有文獻(xiàn)報(bào)道，已在近1000個(gè)不同的人類基因中發(fā)現(xiàn)了7500多個(gè)無(wú)義突變。常規(guī)的基因治療需要為每種疾病設(shè)計(jì)獨(dú)特的治療策略，這將是一項(xiàng)耗費(fèi)驚人的項(xiàng)目。據(jù)此說(shuō)明sup-tRNA的應(yīng)用價(jià)值。發(fā)布：2025/1/3 8:0:1組卷：27引用：1難度：0.6 -
3．幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要成分，自然界有些植物能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶催化幾丁質(zhì)水解從而抵抗真菌感染。通過(guò)基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入沒(méi)有抗性的植物體內(nèi)，可增強(qiáng)其抗真菌的能力。如圖表示為獲取幾丁質(zhì)酶基因而建立cDNA文庫(kù)的過(guò)程。
（1）圖示以mRNA為材料通過(guò)法獲得cDNA，該方法依據(jù)的原理是，通過(guò)這種方法獲得的基因中因缺乏和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致將其直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中不能復(fù)制和表達(dá)。
（2）與選用老葉相比，選用嫩葉更容易提取到mRNA，原因是，且提取RNA時(shí)，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是。
（3）將從cDNA文庫(kù)中獲得的幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體用酶和DNA連接處理后連接起來(lái)，構(gòu)建基因表達(dá)載體，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是。發(fā)布：2025/1/5 8:0:1組卷：5引用：1難度：0.7
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