乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是世界范圍的嚴(yán)重傳染病，HBV的主要抗原性由乙肝病毒表面抗原（HBsAg）體現(xiàn)。巴斯德畢赤酵母含有乙醇氧化酶（AOX1）的強(qiáng)啟動(dòng)子5'AOX1，利用重組巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)高純度人乙肝疫苗對(duì)預(yù)防HBV感染具有重大的社會(huì)效益。如圖為巴斯德畢赤酵母表達(dá)乙肝表面抗原的主要流程，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問題：

（1）組成質(zhì)粒pBSAG151的單體是

脫氧核糖核苷酸

脫氧核糖核苷酸

，5′AOX1是

RNA聚合

RNA聚合

酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)。某興趣小組為擴(kuò)增乙肝病毒表面抗原編碼基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物分別為5′-ATGGAGA-3'、5′-ATGTAAA-3′，結(jié)果無法正確達(dá)成目的，請(qǐng)分析這對(duì)引物不合理的原因可能是

引物序列太短，特異性不強(qiáng)；引物方向錯(cuò)誤

引物序列太短，特異性不強(qiáng)；引物方向錯(cuò)誤

。
（2）將組氨醇脫氫酶基因（HIS4）和利用兩種限制酶

EcoRI和StuI

EcoRI和StuI

切割所得的HBSAg編碼序列插入到啟動(dòng)子5′AOX1和終止子3'AOX1之間構(gòu)成環(huán)狀重組質(zhì)粒pBSAG151。
（3）在回收大片段之前，可將pBSAG151導(dǎo)入處于感受態(tài)的大腸桿菌中，其主要目的是

擴(kuò)增并獲得大量重組質(zhì)粒（目的基因）

擴(kuò)增并獲得大量重組質(zhì)粒（目的基因）

。在借助

電泳

電泳

等技術(shù)回收大片段之前，選用限制酶BglII切割有利于降低DNA分子大小，有助于轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。
（4）為了檢測(cè)是否表達(dá)出HBsAg,應(yīng)從成功導(dǎo)入HBsAg基因的菌株中提取蛋白質(zhì)，用

抗原一抗體雜交

抗原一抗體雜交

方法檢測(cè)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)通過巴斯德畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)生的HBsAg空間結(jié)構(gòu)與血源的HBsAg無顯著差異，遠(yuǎn)優(yōu)于重組大腸桿菌表達(dá)的HBsAg,從細(xì)胞結(jié)構(gòu)上分析，其主要原因是

含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，可對(duì)HIBsAg的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確的加工

含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，可對(duì)HIBsAg的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確的加工

。
（5）如圖為HBsAg基因片段一條鏈的部分堿基排列順序，其中圖1的堿基排列順序已經(jīng)解讀，其順序是：5′-GGTTATGCGT-3'，請(qǐng)解讀圖2顯示的堿基排列順序：

5’-GATGCGTTCG-3'

5’-GATGCGTTCG-3'

。

（6）重組HBV疫苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中，將重組酵母經(jīng)過單細(xì)胞克隆化培養(yǎng)后挑選HBsAg表達(dá)水平高且穩(wěn)定的菌種繼續(xù)

擴(kuò)大培養(yǎng)

擴(kuò)大培養(yǎng)

，后分裝到50～100個(gè)小瓶中在-70℃以下儲(chǔ)存，這些小瓶稱為“母種庫”。從“母種庫”取1瓶或數(shù)瓶母種進(jìn)行再擴(kuò)增，分裝到100～500個(gè)小瓶中，同樣在-70℃以下儲(chǔ)存，這些小瓶稱為“生產(chǎn)菌種庫”，這種菌種系統(tǒng)制備方法的主要優(yōu)勢(shì)是

保證每個(gè)批次的生產(chǎn)菌株都起源于同一重組菌株，確保疫苗品質(zhì)的穩(wěn)定

保證每個(gè)批次的生產(chǎn)菌株都起源于同一重組菌株，確保疫苗品質(zhì)的穩(wěn)定

。