一種天然蛋白t-PA能高效降解因血漿纖維蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和腦血栓的急救藥，但是心?；颊咦⑸浯髣┝康膖-PA會(huì)誘發(fā)顱內(nèi)出血。研究證實(shí)，將t-PA蛋白第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，能顯著降低其誘發(fā)出血的副作用。據(jù)此，先對(duì)天然t-PA基因的堿基序列進(jìn)行改造，然后再采取傳統(tǒng)的基因工程方法表達(dá)該改造后的基因，可制造出性能優(yōu)異的改良t-PA蛋白（注：如圖表示相關(guān)的目的基因、載體及限制酶。pCLY11為質(zhì)粒）。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）利用以上技術(shù)制造出性能優(yōu)異的改良t-PA蛋白的過(guò)程被稱為

蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)

工程。
（2）DNA重組技術(shù)中所選用的質(zhì)粒載體應(yīng)具有以下特征：質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能

自我復(fù)制

自我復(fù)制

；質(zhì)粒DNA分子上有

一至多個(gè)限制酶切位點(diǎn)

一至多個(gè)限制酶切位點(diǎn)

，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有

有標(biāo)記基因（某種抗生素抗性基因）

有標(biāo)記基因（某種抗生素抗性基因）

，便于篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞。
（3）擬改造t-PA基因，須先獲取t-PA基因。若從cDNA文庫(kù)中獲取上t-PA基因，則從CDNA文庫(kù)中獲取的t-PA基因

不含

不含

（填“含有”或“不含”）內(nèi)含子序列。已知t-PA基因比較小，且堿基序列已經(jīng)測(cè)出，也可以通過(guò)

化學(xué)合成（人工合成）

化學(xué)合成（人工合成）

方法獲取t-PA基因。已知t-PA第84位的半胱氨酸對(duì)應(yīng)的模板鏈堿基序列為ACA，絲氨酸的密碼子為UCU。則改造后的t-PA基因第84位的絲氨酸對(duì)應(yīng)的模板鏈堿基序列應(yīng)設(shè)計(jì)為

AGA

AGA

。
（4）若改造后的t-PA基因的粘性末端如上圖所示，則需要選用限制酶

XmaⅠ

XmaⅠ

和

BelⅡ

BelⅡ

切割質(zhì)粒pCLY11，才能保證質(zhì)粒與t-PA改良基因高效連接。改良基因與質(zhì)粒pCLY11構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，需要

DNA連接酶

DNA連接酶

酶催化，該酶催化形成

磷酸二酯鍵

磷酸二酯鍵

鍵。
（5）以大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在含新霉素的培養(yǎng)基中形成菌落的受體細(xì)胞并非都是目的菌株，原因是

導(dǎo)入未連目的基因的質(zhì)粒的大腸桿菌也可以在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

導(dǎo)入未連目的基因的質(zhì)粒的大腸桿菌也可以在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

。這時(shí)需選擇呈

白

白

色的菌落，進(jìn)一步培養(yǎng)檢測(cè)和鑒定，以選育出能生產(chǎn)改良t-PA蛋白的工程菌株。