中國甜柿的自然脫澀與乙醛代謝關(guān)鍵酶基因（PDC）密切相關(guān)，推測澀味程度可能與PDC基因的表達(dá)情況有關(guān)。為篩選PDC基因的調(diào)控蛋白，科研人員構(gòu)建了質(zhì)粒A和質(zhì)粒G（ 如圖1、圖2 所示），利用酵母菌進行了相關(guān)實驗探究。

（1）啟動子位于基因首端，是

RNA聚合酶識別和結(jié)合

RNA聚合酶識別和結(jié)合

的位點，啟動子區(qū)域還存在著許多調(diào)控蛋白的結(jié)合位點，可影響基因的轉(zhuǎn)錄水平。PDC基因的啟動子序列未知，為獲得大量該基因啟動子所在片段，可利用限制酶將基因組DNA進行酶切，然后在

DNA連接酶

DNA連接酶

的作用下將已知序列信息的接頭片段連接在PDC基因的上游，根據(jù)接頭片段和PDC基因編碼序列設(shè)計引物進行

PCR

PCR

。
（2）利用質(zhì)粒A構(gòu)建含有PDC基因啟動子片段的重組質(zhì)粒并導(dǎo)入代謝缺陷型酵母菌，用不含

尿嘧啶

尿嘧啶

的培養(yǎng)基可篩選出成功轉(zhuǎn)化的酵母菌Y1H。質(zhì)粒G上的AD基因表達(dá)出的AD蛋白與啟動子足夠靠近時，能夠激活后續(xù)基因轉(zhuǎn)錄，因此需獲得待測蛋白與AD蛋白的融合蛋白用于后續(xù)篩選?？蒲腥藛T從中國甜柿中提取RNA，將逆轉(zhuǎn)錄形成的各種

cDNA

cDNA

與質(zhì)粒G連接后導(dǎo)入酵母菌，此時應(yīng)選擇質(zhì)粒G中的位點

2

2

（填序號1～5）作為cDNA的插入位點，最終獲得攜帶不同cDNA片段的酵母菌群Y187。
（3）重組酵母Y187與Y1H能夠進行接合生殖，形成的接合子含有兩種酵母菌質(zhì)粒上的所有基因。若接合子能在含有金擔(dān)子素的培養(yǎng)基中生存，則推測待測蛋白是PDC基因的調(diào)控蛋白，請結(jié)合圖3闡述作出該推測的理由

接合子中待測蛋白與AD蛋白形成了融合蛋白，若待測蛋白是PDC基因的調(diào)控蛋白，就能與PDC基因啟動子結(jié)合，AD蛋白也能靠近PDC基因啟動子并激活金擔(dān)子素抗性基因的表達(dá)，使酵母菌表現(xiàn)出金擔(dān)子素抗性

接合子中待測蛋白與AD蛋白形成了融合蛋白，若待測蛋白是PDC基因的調(diào)控蛋白，就能與PDC基因啟動子結(jié)合，AD蛋白也能靠近PDC基因啟動子并激活金擔(dān)子素抗性基因的表達(dá)，使酵母菌表現(xiàn)出金擔(dān)子素抗性

。
（4）篩選出 PDC 基因的調(diào)控蛋白后，為滿足生產(chǎn)上的需要對其進行改良，這種技術(shù)屬于

蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)

工程，該工程的起點是

預(yù)期蛋白質(zhì)的功能

預(yù)期蛋白質(zhì)的功能

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