PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動(dòng)物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡(jiǎn)稱phb2基因），利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白?；卮鹣铝袉?wèn)題：
（1）為獲取phb2基因，提取該動(dòng)物肝臟組織的RNA，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程得到cDNA，將其作為PCR反應(yīng)的模板，并設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物來(lái)擴(kuò)增目的基因。圖為所用載體圖譜示意圖，質(zhì)粒DNA含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子作用是

RNA聚合酶識(shí)別結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA

RNA聚合酶識(shí)別結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA

。

名稱	識(shí)別序列及切割位點(diǎn)	名稱	識(shí)別序列及切割位點(diǎn)
HindⅢ	A↓AGCTT	EcoRⅠ	G↓AATTC
PvitⅡ	CAG↓CTG	PstⅠ	CTGC↓AG
KpnⅠ	G↓GTACC	BamHⅠ	G↓GATCC

注：箭頭表示切割位點(diǎn)
（2）構(gòu)建基因表達(dá)載體需要用到限制酶和DNA連接酶，其中，DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是

磷酸二酯鍵

磷酸二酯鍵

。圖1中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見(jiàn)表，為使phb2基因（該基因序列不含圖中限制酶的識(shí)別序列）與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入

PvitⅡ

PvitⅡ

和

EcoRⅠ

EcoRⅠ

兩種不同限制酶的識(shí)別序列。經(jīng)過(guò)這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用

T₄DNA連接酶

T₄DNA連接酶

（填“E?coliDNA連接酶”或“T₄DNA連接酶”）。
（3）轉(zhuǎn)化前需用

CaCl₂

CaCl₂

處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于

感受態(tài)/一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

感受態(tài)/一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

，以提高轉(zhuǎn)化效率。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含

氨芐青霉素

氨芐青霉素

的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。