CAV-2（犬2型腺病毒）弱毒株廣泛應(yīng)用于基因治療載體和病毒活疫苗載體研究。該病毒的E3區(qū)為病毒復(fù)制的非必需區(qū)，構(gòu)建缺失E3區(qū)的CAV-2載體，可以提高CAV-2外源基因容量。過(guò)程如圖。

（1）過(guò)程①中擴(kuò)增E3區(qū)上/下游同源重組臂的技術(shù)為

PCR

PCR

技術(shù)，該技術(shù)中用到的關(guān)鍵酶是

taqDNA聚合（taq）

taqDNA聚合（taq）

酶。設(shè)計(jì)擴(kuò)增上游同源重組臂的1對(duì)引物時(shí)，分別引入EcoRⅠ位點(diǎn)和KpnⅠ、SpeⅠ位點(diǎn)。設(shè)計(jì)下游同源重組臂的1對(duì)引物時(shí)，分別引入KpnⅠ位點(diǎn)和HindⅢ位點(diǎn)。在反應(yīng)體系中加入CAV-2基因組DNA的作用 

作為模板

作為模板

。
（2）過(guò)程②中，上游同源重組臂經(jīng)

EcoRⅠ/KpnⅠ

EcoRⅠ/KpnⅠ

酶切，下游同源重組臂經(jīng)

KpnⅠ/HindⅢ

KpnⅠ/HindⅢ

酶切，再將他們與經(jīng)EcoRⅠ/HindⅢ酶切的Puc18質(zhì)粒連接在一起，形成pUC-△E3質(zhì)粒。
（3）過(guò)程③中，設(shè)計(jì)兩端引物時(shí)，都引入

SpeⅠ

SpeⅠ

位點(diǎn)，經(jīng)酶切得到的含EGFP（增強(qiáng)綠色熒光蛋白）等序列的DNA片段A。DNA片段A和pUC-△E3質(zhì)粒經(jīng)SpeⅠ酶切后，連接在一起。因?yàn)?bdo class="mathjye-underline"> 

連接方向可能錯(cuò)誤（自身環(huán)化）

連接方向可能錯(cuò)誤（自身環(huán)化）

，所以還需經(jīng)過(guò)鑒定和篩選才能得到pUC-△E3-EGFP質(zhì)粒。
（4）CAV-2感染犬腎上皮細(xì)胞后，導(dǎo)入pUC-△E3-EGFP質(zhì)粒，經(jīng)多次純化后，得到重組的CAV-2病毒，這種病毒的變異類(lèi)型屬于 

基因重組

基因重組

。
（5）基因工程應(yīng)用過(guò)程中，外源基因可能會(huì)與感染轉(zhuǎn)基因生物的某些病毒雜交，從而重組出對(duì)人類(lèi)或其他生物有害的病原體，這是引發(fā)了人們?cè)?bdo class="mathjye-underline"> 

生物

生物

安全方面發(fā)生了激烈的爭(zhēng)論的原因之一。