香蘭素是從香莢蘭豆中提取的天然香料，因產(chǎn)量低而價格昂貴。近年來的生產(chǎn)實踐中常用擬無枝酸菌生產(chǎn)香蘭素，但香蘭素在香蘭素脫氫酶的作用下會進一步降 解。科研人員擬通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)（由一條單鏈向導RNA和核酸內(nèi)切酶Cas9組成），敲除擬無枝酸菌的香蘭素脫氫酶基因（VDH），以提高香蘭素的產(chǎn)量。圖1是選擇VDH基因中特定位點進行切割的示意圖，圖2是設計CRISPR-Cas9系統(tǒng)向導RNA中的識別序列，并構建可用于敲除VDH 基因的質粒的主要過程。請回答下列問題：
（1）核酸內(nèi)切酶Cas9可催化

磷酸二酯鍵

磷酸二酯鍵

鍵的水解。利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除VDH基因的內(nèi)部大片段屬于

基因突變

基因突變

（變異類型）。
（2）圖2中，過程A使用的4種引物序列如下：
引物 1  5'-GAGTCGAAGCTTTTTTTGAGAGCTCGTCCCACGACG-3'
引物 2  5'-GGTCGTTGATGTCCACTTCTCGTCGTCGAG-3'
引物 3  5'-AGAAGTGGACATCAACGACCAGACGGTCAAC-3'
引物 4  5'-CGACGGCCAGTGCCAAGCTTTGCGAGCACCTGGAGAAGG-3'
①利用PCR1和PCR2分別擴增VDH基因的部分片段，獲得VDH基因上游和下游同源臂（VDH-F和VDH-R），這兩個PCR不能放在同一系統(tǒng)中同時進行，這是因為

引物2和3中存在互補配對片段，置于同一反應系統(tǒng)時它們會發(fā)生結合而失去作用，導致擴增完整的VDH基因

引物2和3中存在互補配對片段，置于同一反應系統(tǒng)時它們會發(fā)生結合而失去作用，導致擴增完整的VDH基因

。
②PCR3反應系統(tǒng)中加入的引物有

引物1和引物4

引物1和引物4

，此外還應加入模板DNA（VDH-F和VDH-R）、Mg²⁺、緩沖液、

Taq酶、4種脫氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）等

Taq酶、4種脫氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）等

等，適宜條件下擴增得到VDH-F和VDH-R的融合片段。
（3）圖2中，完成過程B需要加入的酶有

HindIII和DNA連接酶

HindIII和DNA連接酶

。將質粒2導入擬無枝酸菌前，用

Ca²⁺（或CaCl₂）

Ca²⁺（或CaCl₂）

處理使菌株處于感受態(tài)，導入后將菌液利用

稀釋涂布平板（或平板劃線法）

稀釋涂布平板（或平板劃線法）

法接種到添加

安普霉素

安普霉素

的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)獲得多株轉化菌株。
（4）通過篩選獲得的轉化菌株需要從個體水平進行生產(chǎn)性能測試。請寫出基本思路

將菌株接種到適合培養(yǎng)基中，置于溫度等適宜條件下培養(yǎng)，一段時間后取樣檢測培養(yǎng)液中香蘭素的濃度

將菌株接種到適合培養(yǎng)基中，置于溫度等適宜條件下培養(yǎng)，一段時間后取樣檢測培養(yǎng)液中香蘭素的濃度

。