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纖維素酶的分子改造
纖維素酶的分子改造先后經(jīng)歷了以下3個階段:以定點突變?yōu)榛A的“定點理性設計”;以易錯PCR等技術主導的“定向跡化”;以數(shù)據(jù)驅(qū)動設計或結構生物信息學指導的“構理性設計”。
20世紀80年代,隨著定點突變技術的快速發(fā)展,纖維素酶理性改變策略應運而生。該技術的基本思路是:先研究分析纖維素酶的三維結構信息,再基于對其結構與功能關系的理解,選定特定的氨基酸進行改造,找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)。常用的定點突變技術是重疊延伸PCR(過程如圖1),可對目的基因特定堿基進行定點替提、缺失或者插入,實現(xiàn)對目的蛋白的改造。
然而,目前僅獲得了纖維素酶家族的少數(shù)成員三維結構,通過定點突變?yōu)榇睦硇栽O計進行纖維素酶分子的改造在短期內(nèi)仍難以獲得廣泛的成效。因此,采用“非理性”設計就成為一種重要的研究手段。所謂“非理性”設計,即定向進化,就是在對蛋白質(zhì)的三維結構及催化機制不是很清楚的條件下,模擬自然進化過程,利用易錯PCR等技術對基因進行隨機突變,提高基因突變頻率和基因突變的多樣性,并與定向篩選策略結合,最終獲得具有某些優(yōu)良特性的酶分子(過程如圖2)。
盡管定向進化技術在對纖維素酶進行改造時可能會得到意想不到的“有益收獲”,但由于對要改造的蛋白質(zhì)分子結構信息并不清楚,因此操作起來具有明顯的“盲目性”。
近十年隨著計算機運算能力大幅提升以及先進算法不斷涌現(xiàn),計算機輔助蛋白質(zhì)設計改造得到了較大的重視和發(fā)展,形成了“構理性設計”的新策略。這一策略借助蛋白質(zhì)保守位點及蛋白質(zhì)的三維結構分析,通過非隨機的方式選取若干個氨基酸位點作為改造點,并結合有效密碼子的理性選用。構建“小而精”的突變體文庫。與定向進化相比,“結構理性設計”可提供明確的改造方案,大幅降低建立、篩選突變體文庫所需的工搾量,增大理性設計成功的概率。
(1)纖維素酶的分子改造過程屬于蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)工程。
(2)根據(jù)圖1所示的疊延伸PCR過程,回答下列問題。
①PCR擴增DNA的過程中,引物a、b、c、d中,PCR1應選擇引物a和ba和b,PCR2應選擇引物c和dc和d,重疊延伸時應選擇引物a和da和d。
②重疊延伸PCR通過在引物b和c上引入突變在引物b和c上引入突變實現(xiàn)定點突變,引物b和c上的突變位點的堿基應互補配對互補配對。PCR1和PCR2需要分別進行的原因是引物b和引物c可以互補配對,導致引物失效引物b和引物c可以互補配對,導致引物失效。
(3)請據(jù)圖2寫出用定向進化策略改造纖維素酶的操作過程:利用易錯PCR等技術對纖維素基因進行隨機突變→將突變纖維素酶基因與載體相連,構建基因表達載體→將突變纖維素酶基因(重組表達載體)導入大腸桿菌(受體細胞)→具有某些優(yōu)良特性的酶的篩選與鑒定利用易錯PCR等技術對纖維素基因進行隨機突變→將突變纖維素酶基因與載體相連,構建基因表達載體→將突變纖維素酶基因(重組表達載體)導入大腸桿菌(受體細胞)→具有某些優(yōu)良特性的酶的篩選與鑒定。
(4)用定向進化策略改造纖維素酶,下列哪些說法正確ACDEACDE。
A.定向進化策略可以使纖維素酶朝著人們需要的方向進化
B.定向進化策略獲得的纖維素酶的基因序列在篩選前是已知的
C.定向進化策略的實質(zhì)是達爾文進化論在分子水平上的延伸和應用
D.與定點誘變相比,定向進化策略不需解析酶的結構和功能,更接近自然進化過程
E.基因工程技術是定向進化策略改造纖維素的基礎
(5)有人認為,以數(shù)據(jù)驅(qū)動設計或結構生物信息學指導的“結構理性設計”必將成為纖維素酶的分子改造的主流方向,該說法是否正確,請結合本文作出判斷,并撰寫一段文字,向公眾進行科學解釋。
【考點】DNA片段的擴增與電泳鑒定.
【答案】蛋白質(zhì);a和b;c和d;a和d;在引物b和c上引入突變;互補配對;引物b和引物c可以互補配對,導致引物失效;利用易錯PCR等技術對纖維素基因進行隨機突變→將突變纖維素酶基因與載體相連,構建基因表達載體→將突變纖維素酶基因(重組表達載體)導入大腸桿菌(受體細胞)→具有某些優(yōu)良特性的酶的篩選與鑒定;ACDE
【解答】
【點評】
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