火龍果在低溫下幼嫩莖段會(huì)部分受到傷害，脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（LTPs）被證實(shí)在植物抵抗低溫脅迫中有重要作用，控制該蛋白合成的基因結(jié)構(gòu)如圖1所示。某課題研究組將LTP基因?qū)牖瘕埞鷤M織，以獲得抗寒能力強(qiáng)的火龍果。回答下列問題：
（1）采用PCR技術(shù)克隆LTP基因時(shí)，為使目的基因能與圖2所示的載體準(zhǔn)確連接，將NcoI和BstEII兩種限制酶的識(shí)別序列分別添加在引物

4

4

、引物

1

1

（填引物編號(hào)）的

5'

5'

（填“3'端”或“5'端”）。
（2）將構(gòu)建的表達(dá)載體與經(jīng)

氯化鈣

氯化鈣

處理獲得的感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌混合，通過液體懸浮培養(yǎng)完成

轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化

和細(xì)胞復(fù)蘇，再將菌液涂布在含

卡那霉素

卡那霉素

的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，以獲得

導(dǎo)入LTP基因（含重組質(zhì)粒）

導(dǎo)入LTP基因（含重組質(zhì)粒）

的根癌農(nóng)桿菌。
（3）從田間取得的火龍果莖段經(jīng)

消毒

消毒

處理后，誘導(dǎo)其

脫分化

脫分化

形成愈傷組織，加入（2）中獲得的根癌農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)入含抗生素的培養(yǎng)基，此時(shí)添加抗生素的主要目的是

去除根癌農(nóng)桿菌

去除根癌農(nóng)桿菌

。
（4）經(jīng)上述處理后的愈傷組織放入含X-Gluc的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選取

未變藍(lán)色（白色）

未變藍(lán)色（白色）

色的愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)得到幼苗。為進(jìn)一步確定該幼苗中的LTP基因是否表達(dá)，從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，經(jīng)處理固定在硝酸纖維素膜上，讓待測(cè)蛋白質(zhì)與

抗脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的抗體探針（帶標(biāo)記的抗脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的抗體）

抗脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的抗體探針（帶標(biāo)記的抗脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的抗體）

發(fā)生抗原抗體雜交。除分子水平的檢測(cè)方法外，還可以用

將火龍果再生植株進(jìn)行低溫處理，觀察其是否能在低溫條件下正常生長(zhǎng)以確定其是否獲得了新性狀

將火龍果再生植株進(jìn)行低溫處理，觀察其是否能在低溫條件下正常生長(zhǎng)以確定其是否獲得了新性狀

。

（注：圖1箭頭表示目的基因的轉(zhuǎn)錄方向；圖2：NcoI和BstEII為不同限制酶的識(shí)別位點(diǎn)；T-DNA中標(biāo)出的啟動(dòng)子屬于真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)；GUS基因編碼產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酸酶能將無(wú)色物質(zhì)X-Gluc分解，使植物組織呈藍(lán)色，否則為白色）