奶牛乳房炎是奶牛常見的疾病，無乳鏈球菌是引起該病的一種致病菌。enolase蛋白是無乳鏈球菌中的一種蛋白，該蛋白能夠引起宿主的特異性免疫應(yīng)答，可用于制備防控?zé)o乳鏈球菌的疫苗。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有蛋白產(chǎn)量高的優(yōu)勢，某研究小組嘗試?yán)么竽c桿菌表達(dá)并純化enolase蛋白，該研究實驗步驟如下。請回答下列問題：
（1）首先利用PCR分別擴(kuò)增出目的基因片段（enolase蛋白基因）以及pET-32a（+）質(zhì)粒載體片段，PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg²⁺，原因是

真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg²⁺激活

真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg²⁺激活

。每次PCR循環(huán)一般可以分為

變性、復(fù)性和延伸

變性、復(fù)性和延伸

三步。
（2）將enolase蛋白基因連接至pET-32a（+）質(zhì)粒載體上，先要用限制酶切割載體，然后用同種限制酶或者能產(chǎn)生

相同黏性末端

相同黏性末端

的限制酶切割含有目的基因的片段，再用DNA連接酶進(jìn)行連接。重組表達(dá)質(zhì)粒（結(jié)構(gòu)如圖所示）調(diào)控序列中有著能夠高效表達(dá)的啟動子，它是與

RNA聚合酶識別和結(jié)合

RNA聚合酶識別和結(jié)合

的部位。質(zhì)粒上的Amp,可用于

重組DNA分子的篩選

重組DNA分子的篩選

。由圖可知，質(zhì)粒上不同基因轉(zhuǎn)錄時，模板鏈

不一定

不一定

（選填“一定”或“不一定”）是同一條DNA單鏈。
（3）為了將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，先用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理大腸桿菌細(xì)胞，然后再將重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入其中。將分離純化獲得的enolase蛋白注入健康的小鼠體內(nèi)，通過測定小鼠血清中

抗enolase蛋白的抗體

抗enolase蛋白的抗體

的含量，可用于評價enolase蛋白疫苗的免疫效果和安全性。