1965年中國科學(xué)家人工合成了具有生物活性的結(jié)晶牛胰島素，摘取了人工合成蛋白質(zhì)的桂冠。人胰島素基因表達(dá)的最初產(chǎn)物是一條肽鏈構(gòu)成的前胰島素原，經(jīng)圖1所示的過程形成具生物活性的胰島素。此后科學(xué)家又提出了利用基因工程改造大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素的兩種方法：AB法是根據(jù)胰島素A、B兩條肽鏈的氨基酸序列人工合成兩種DNA片段，利用工程菌分別合成兩條肽鏈后將其混合自然形成胰島素；BCA法是利用胰島B細(xì)胞中的mRNA得到胰島素基因，表達(dá)出胰島素原后再用特定酶切掉C肽段。這兩種方法使用同一種質(zhì)粒作為載體。請分析并回答下列問題：

（1）在人體胰島B細(xì)胞內(nèi)，圖1中前胰島素原形成具生物活性的胰島素過程中參與的細(xì)胞器有

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體

。
（2）由于密碼子具有

簡并性

簡并性

，AB法中人工合成的兩種DNA片段均有多種可能的序列。

AB和BCA

AB和BCA

（填“AB”、“BCA”或“AB和BCA”）法獲取的目的基因中不含人胰島素基因啟動(dòng)子。
（3）圖2是利用基因工程生產(chǎn)人胰島素過程中使用的質(zhì)粒及目的基因的部分結(jié)構(gòu)。為使目的基因與載體正確連接，在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)可添加限制酶

XhoⅠ和MunⅠ

XhoⅠ和MunⅠ

的識別序列。通過上述方法獲得人的胰島素基因后，需要通過PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，已知胰島素基因左端①處的堿基序列為-CCTTTCAGCTCA-，則其中一種引物設(shè)計(jì)的序列是5′

—CTCGAGCCTTTCAGCTCA—

—CTCGAGCCTTTCAGCTCA—

3′。
（4）對重組表達(dá)載體進(jìn)行酶切鑒定，若選擇限制酶SalⅠ，最多能獲得

7

7

種大小不同的DNA片段。
（5）β-半乳糖苷酶可以分解無色的X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落為白色。經(jīng)Ca²⁺處理的大腸桿菌與重組質(zhì)?；旌吓囵B(yǎng)一段時(shí)間后，采用

稀釋涂布平板

稀釋涂布平板

法將大腸桿菌接種到添加了

氨芐青霉素和X-gal

氨芐青霉素和X-gal

的培養(yǎng)基上篩選出

白

白

色的菌落即為工程菌種。
（6）科學(xué)家利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，研制出了賴脯胰島素，與天然胰島素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。獲得賴脯胰島素基因的途徑是：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→

設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

→推測應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列。