科學家卡彭蒂娜和杜德娜發(fā)現(xiàn)，細菌中存在清除入侵病毒 DNA 的功能系統(tǒng)，并發(fā)明了 CRISPR/Cas9 基因編輯技術，因此獲得 2020 年諾貝爾化學獎。該系統(tǒng)主要包含向導 RNA（sgRNA）和Cas9 蛋白兩部分，sgRNA 能特異性識別結合特定的 DNA 序列，從而引導 Cas9 蛋白到相應位置剪切 DNA，最終實現(xiàn)對靶基因序列定點編輯，其工作原理如圖 1所示?？蒲腥藛T通過誘變得到喪失剪接功能的 dCas9，并建構 CRISPR/dCas9 系統(tǒng)，保留了sgRNA引導進入基因組的能力；dCas9 與 VP64、P65 等轉錄激活因子融合，形成的 dCas9-SAM 可用于基因調控等研究。
（1）CRISPR/Cas9系統(tǒng)能精準識別相關基因，依據的原理是 sgRNA與目標DNA 發(fā)生 堿基互補配對堿基互補配對；Cas9 蛋白可催化 磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵（填化學鍵名稱）水解，剪切特定 DNA 片段。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)廣泛存在于細菌等原核生物中的生理意義是 防止外源基因插入和表達，保證原核生物自身安全和遺傳穩(wěn)定防止外源基因插入和表達，保證原核生物自身安全和遺傳穩(wěn)定。
（2）將 OCT4、KLF4、MYC及SOX2 四個基因的 sgRNA 序列串聯(lián)成的sgRNA質粒和 dCas9-SAM質粒與磷脂等混合，形成包埋 DNA 脂質體，將脂質體加入細胞系 MCF7的細胞培養(yǎng)皿中，即可將外源 DNA 導入細胞中。24h后通過添加 抗生素G418和嘌呤霉素抗生素G418和嘌呤霉素篩選并進行單細胞培養(yǎng)即可得到基因編輯后的細胞。此過程須在37℃，氣體環(huán)境為 95%空氣加5%CO2的混合氣體95%空氣加5%CO2的混合氣體的細胞培養(yǎng)箱中進行。該實驗通過4種 sgRNA 對 MCF7 細胞進行基因編輯，可實現(xiàn)多基因 同時調控（或表達）同時調控（或表達）的目的。
（3）實驗發(fā)現(xiàn)，CRISRP/Cas9 基因編輯技術有時存在編輯對象出錯而造成“脫靶“，sgRNA 的序列長短影響成功率，序列越短，脫靶率越高。分析脫靶最可能的原因：非基因編輯對象也可能含有與sgRNA配對的堿基序列，造成sgRNA選錯對象與之錯誤結合而脫靶非基因編輯對象也可能含有與sgRNA配對的堿基序列，造成sgRNA選錯對象與之錯誤結合而脫靶。
（4）為了獲得某水稻品種的不育系，研究人員利用 Cas9 蛋白對該品種的 TMS5 基因進行編輯。首先從水稻組織中提取總RNA，經逆轉錄獲得總 cDNA，然后通過PCR技術可準確擴增出 TMS5 基因，原因是 加入的特定引物能與總cDNA中TMSS基因特異性結合加入的特定引物能與總cDNA中TMSS基因特異性結合。在篩選出成功導入 TMS5 基因表達載體的水稻愈傷組織后，經多代培養(yǎng)仍能提取出TMS5 基因，你認為 TMS5 基因是否已成功轉化？說明你的觀點及理由：不一定，轉化是指目的基因成功導入受體細胞并穩(wěn)定存在和表達，僅提取到TMS5基因不能說明它能否正常表達不一定，轉化是指目的基因成功導入受體細胞并穩(wěn)定存在和表達，僅提取到TMS5基因不能說明它能否正常表達。
【考點】基因工程的操作過程綜合．
【答案】堿基互補配對；磷酸二酯鍵；防止外源基因插入和表達，保證原核生物自身安全和遺傳穩(wěn)定；抗生素G418和嘌呤霉素；95%空氣加5%CO2的混合氣體；同時調控（或表達）；非基因編輯對象也可能含有與sgRNA配對的堿基序列，造成sgRNA選錯對象與之錯誤結合而脫靶；加入的特定引物能與總cDNA中TMSS基因特異性結合；不一定，轉化是指目的基因成功導入受體細胞并穩(wěn)定存在和表達，僅提取到TMS5基因不能說明它能否正常表達
【解答】
【點評】
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發(fā)布：2024/4/20 14:35:0組卷：23引用：3難度：0.7
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（1）獲得轉基因抗鹽煙草新品種過程中應用的生物技術有（答出2項）等。
（2）為確保目的基因定向插入了質粒，應該選擇（填酶）切割目的基因和質粒。在培養(yǎng)基中加入（填“氨芐青霉素”或“四環(huán)素”）對目的基因進行篩選。
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發(fā)布：2024/12/20 3:30:1組卷：6引用：1難度：0.6
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