黨的二十大對(duì)保障糧食安全提出了更高要求，馬鈴薯是我國(guó)重要的糧食作物之一。致病疫霉導(dǎo)致的晚疫病及干旱、高低溫和鹽脅迫等是導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)的重要原因。研究人員為探究StNPR4和tproNPR4基因在馬鈴薯應(yīng)對(duì)致病疫霉和高鹽脅迫中的功能進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，基因表達(dá)載體構(gòu)建示意圖如圖1。

（1）用SacⅡ等限制酶切割含目的基因的DNA片段，與經(jīng)相同酶切割后的pENTR-L16質(zhì)粒用

DNA連接

DNA連接

酶連接，構(gòu)建重組pENTR-L16。
（2）經(jīng)

SaclI和Kpn1

SaclI和Kpn1

酶將含目的基因的片段切出并連接到載體pORE04上構(gòu)建重組pORE04。
（3）將重組pORE04導(dǎo)入馬鈴薯細(xì)胞常用的方法是

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

法，它利用了T-DNA的

可轉(zhuǎn)移

可轉(zhuǎn)移

特性，最終使目的基因整合到馬鈴薯細(xì)胞上。經(jīng)轉(zhuǎn)化后得到5個(gè)品系，命名為1、2、3、4和5。圖2A表示馬鈴薯基因相對(duì)表達(dá)量分析，圖2B表示馬鈴薯接種致病疫霉后病原菌相對(duì)生物量分析，圖2C表示150mmol?L^-1的NaCl處理對(duì)馬鈴薯快繁生根率的影響，**表示組別間差異達(dá)到極顯著水平。
①據(jù)圖2A分析，只有轉(zhuǎn)基因品系

5

5

的表達(dá)量顯著低于野生型（WT）和其余4個(gè)轉(zhuǎn)化品系，因此后續(xù)試驗(yàn)不再檢測(cè)此品系。
②據(jù)圖2B和圖2C分析，與野生型馬鈴薯比較，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系的優(yōu)勢(shì)是具有

抗病性

抗病性

，致病疫霉相對(duì)生物量低：生根率高，

存活能力強(qiáng)

存活能力強(qiáng)

。
（4）為研究轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的分子機(jī)理，研究人員利用Taqman探針和反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯StproNPR4和StNPR4基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)：
采用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增StproNPR4基因，需要使用的引物2序列為5'-CTTGGATGAT-3'，則引物1的序列為

5'-TCTGTT-3'

5'-TCTGTT-3'

（標(biāo)出5'和3端，寫出前6個(gè)堿基即可）。
②Tagman探針的結(jié)構(gòu)如圖3所示，由于探針有

堿基互補(bǔ)配對(duì)

堿基互補(bǔ)配對(duì)

的片段，導(dǎo)致游離探針上的熒光素會(huì)與淬滅劑結(jié)合無(wú)法發(fā)出熒光。在PCR過程中，Taq酶體現(xiàn)出

DNA聚合

DNA聚合

酶活性，在相同擴(kuò)增時(shí)間中，總熒光值與待測(cè)基因的

mRNA（轉(zhuǎn)錄）量

mRNA（轉(zhuǎn)錄）量

成正比。
③經(jīng)檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯水楊酸（SA）信號(hào)通路相關(guān)蛋白基因表達(dá)量顯著上升，SA是一種植物抗病有關(guān)的調(diào)節(jié)物質(zhì)。研究人員推測(cè)L儀器檢測(cè)通過激活SA途徑提升抗病能力，欲驗(yàn)證這一假設(shè)，需要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)是

敲除SA受體基因或抑制SA信號(hào)途徑，檢測(cè)馬鈴薯的抗病情況

敲除SA受體基因或抑制SA信號(hào)途徑，檢測(cè)馬鈴薯的抗病情況

。