抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）在人體中主要由肝臟合成，是存在于血漿中的一種重要的抗凝血因子。研究者將人的抗凝血酶Ⅲ基因?qū)肽躺窖蚣?xì)胞，獲得乳汁中含有大量重組人的抗凝血酶Ⅲ的轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊。已知β-酪蛋白廣泛存在于哺乳動(dòng)物的乳汁中?；卮鹣铝袉?wèn)題：
（1）抗凝血酶Ⅲ基因的獲得與表達(dá)載體的構(gòu)建：從人的

肝細(xì)胞

肝細(xì)胞

中獲得抗凝血酶Ⅲ基因的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并利用

PCR

PCR

技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。為順利將抗凝血酶Ⅲ基因連接到奶山羊β-酪蛋白基因表達(dá)載體上，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)在引物前加入

限制酶的識(shí)別序列

限制酶的識(shí)別序列

特地選用β-酪蛋白基因表達(dá)載體的原因是

β-酪蛋白基因啟動(dòng)子會(huì)在乳腺細(xì)胞中起作用

β-酪蛋白基因啟動(dòng)子會(huì)在乳腺細(xì)胞中起作用

。與抗凝血酶III基因一起連接到基因表達(dá)載體上的還有新霉素抗性基因，該基因的作用是

用于篩選含有目的基因的受體細(xì)胞

用于篩選含有目的基因的受體細(xì)胞

。
（2）山羊成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化和篩選：取幼齡雌性動(dòng)物的組織，經(jīng)

機(jī)械切割和胰蛋白酶處理

機(jī)械切割和胰蛋白酶處理

處理后獲得成纖維細(xì)胞懸液，將帶有ATⅢ轉(zhuǎn)基因載體的脂質(zhì)體（由磷脂和膽固醇組成的脂質(zhì)雙分子層所構(gòu)成的封閉囊泡）與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，獲得含有目的基因的受體細(xì)胞，該轉(zhuǎn)化方法的原理是

細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性

細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性

。
（3）轉(zhuǎn)基因奶山羊的克?。簩⒔?jīng)

營(yíng)養(yǎng)限制性培養(yǎng)

營(yíng)養(yǎng)限制性培養(yǎng)

培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞取核移入去核卵母細(xì)胞中，用

電刺激

電刺激

處理后進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)。在移植到

同期發(fā)情

同期發(fā)情

的代孕母羊的子宮前，應(yīng)將早期胚胎培養(yǎng)在

一系列含有不同成分

一系列含有不同成分

的培養(yǎng)液中。代孕母羊懷孕、分娩獲得轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊。
（4）人的抗凝血酶Ⅲ的分子量大小及含量檢測(cè)：收集轉(zhuǎn)基因羊的羊奶和正常對(duì)照羊奶進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳，使不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠上分開，根據(jù)與

蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物和空白對(duì)照

蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物和空白對(duì)照

比較，確定奶中抗凝血酶Ⅲ的分子量大小。利用

熒光標(biāo)記的抗人的抗凝血酶Ⅲ抗體

熒光標(biāo)記的抗人的抗凝血酶Ⅲ抗體

與人的抗凝血酶Ⅲ進(jìn)行特異性結(jié)合，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷羊奶中抗凝血酶Ⅲ的含量。若最終獲得的抗凝血酶Ⅲ不能很好地行使其功能，可利用

蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)

工程進(jìn)行改造。