血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是在腫瘤細(xì)胞中通過(guò)表達(dá)，分泌到血液中的蛋白質(zhì)類生長(zhǎng)因子，促進(jìn)腫瘤血管的生成，進(jìn)而為腫瘤組織生長(zhǎng)提供足夠的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。研究人員利用pVAX1質(zhì)粒和VEGF基因構(gòu)建了pVAX1-VEGF的DNA疫苗，為腫瘤免疫治療奠定基礎(chǔ)?；卮鹣铝袉?wèn)題：
（1）首先從人的肺癌細(xì)胞株A549中提取mRNA，通過(guò)

反轉(zhuǎn)錄法

反轉(zhuǎn)錄法

獲得VEGF基因。
（2）對(duì)獲取的VEGF基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，需要根據(jù)VEGF基因序列設(shè)計(jì)兩種引物，而不是一種引物，其原因是

基因的兩條反向平行的鏈都做模板，其堿基序列不同

基因的兩條反向平行的鏈都做模板，其堿基序列不同

。為便于VEGF基因與質(zhì)粒pVAX連接，需要在引物的

5'

5'

端加上相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增時(shí)，每個(gè)循環(huán)一般要經(jīng)歷“變性、復(fù)性、延伸”三個(gè)過(guò)程，其中

復(fù)性

復(fù)性

溫度過(guò)高，則引物無(wú)法與

DNA模板

DNA模板

結(jié)合，
可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物。
（3）構(gòu)建的pVAX1-VEGF上應(yīng)含有特定的

啟動(dòng)子

啟動(dòng)子

（填“復(fù)制原點(diǎn)”“啟動(dòng)子”或“標(biāo)記基因”），它能被受體細(xì)胞的

RNA聚合酶

RNA聚合酶

所識(shí)別，以便于驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。