重組質(zhì)粒pMM085常用來(lái)生產(chǎn)工程疫苗，但因含氯霉素抗性基因cat,有增加環(huán)境中抗藥基因的風(fēng)險(xiǎn)。pKD46是一種熱敏感型工具質(zhì)粒，只能在低于37℃的溫度條件下穩(wěn)定存在，它攜帶的Red基因在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下表達(dá)Red重組蛋白，通過(guò)體內(nèi)同源重組進(jìn)行靶向基因敲除，原理如圖1所示。asd基因編碼細(xì)菌二氨基庚二酸（DAP）合成途徑的關(guān)鍵酶，DAP是大腸桿菌細(xì)胞壁的主要成分，當(dāng)asd基因缺失時(shí)，將導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)對(duì)DAP的依賴(lài)性。研究人員將質(zhì)粒pMM085和pKD46導(dǎo)入asd缺失型大腸桿菌中，通過(guò)Red同源重組，將pMM085中的cat基因替換為asd基因，構(gòu)建無(wú)抗性菌苗株，如圖2所示。

（1）據(jù)圖1分析，與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，Red體內(nèi)同源重組具有的特點(diǎn)是：

在活細(xì)胞內(nèi)完成，無(wú)需使用限制酶和DNA連接酶，即可實(shí)現(xiàn)靶基因的敲除或替換（可以擺脫限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)限制）

在活細(xì)胞內(nèi)完成，無(wú)需使用限制酶和DNA連接酶，即可實(shí)現(xiàn)靶基因的敲除或替換（可以擺脫限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)限制）

。
（2）無(wú)抗藥性菌苗的構(gòu)建過(guò)程中（圖2），①中應(yīng)先用

Ca²⁺（或CaCL₂）

Ca²⁺（或CaCL₂）

處理，使asd基因缺陷型大腸桿菌處于感受態(tài)，然后將pMM085和pKD46轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)

阿拉伯糖

阿拉伯糖

誘導(dǎo)后，電擊導(dǎo)入asd基因，獲得重組質(zhì)粒。
（3）將②中獲得的菌液采用

稀釋涂布平板法

稀釋涂布平板法

方法接種到LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)得到單菌落。37℃培養(yǎng)的目的是

①大腸桿菌生長(zhǎng)的適宜溫度；②清除pKD46質(zhì)粒

①大腸桿菌生長(zhǎng)的適宜溫度；②清除pKD46質(zhì)粒

。（請(qǐng)答出兩點(diǎn)）

（4）挑取步驟③中獲得的10個(gè)單菌落細(xì)胞進(jìn)行PCR鑒定，得到電泳圖譜（圖3），電泳結(jié)果說(shuō)明

轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌細(xì)胞中同時(shí)含有pMM085和pMM085-asd重組質(zhì)粒

轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌細(xì)胞中同時(shí)含有pMM085和pMM085-asd重組質(zhì)粒

?？蒲腥藛T在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上重新提?、壑匈|(zhì)粒再轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選后獲得僅含重組質(zhì)粒的單菌落，請(qǐng)簡(jiǎn)要寫(xiě)出篩選的思路

挑取單菌落細(xì)胞接種到不含DAP的LB培養(yǎng)基中，能生長(zhǎng)的菌落為pMM085-asd重組質(zhì)粒或pMM085和pMM085-asd的混合質(zhì)粒；再分別挑取單菌落的細(xì)胞接種到含有氯霉素的LB培養(yǎng)基中，不能生長(zhǎng)的為僅含pMM085-asd重組質(zhì)粒的無(wú)抗藥性大腸桿菌菌苗。

挑取單菌落細(xì)胞接種到不含DAP的LB培養(yǎng)基中，能生長(zhǎng)的菌落為pMM085-asd重組質(zhì)粒或pMM085和pMM085-asd的混合質(zhì)粒；再分別挑取單菌落的細(xì)胞接種到含有氯霉素的LB培養(yǎng)基中，不能生長(zhǎng)的為僅含pMM085-asd重組質(zhì)粒的無(wú)抗藥性大腸桿菌菌苗。

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