PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動(dòng)物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡(jiǎn)稱phb2基因），大小為1.5kb（1kb=1000堿基對(duì)），利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白。如圖為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見(jiàn)表?；卮鹣铝袉?wèn)題：

（1）為獲取phb2基因，提取該動(dòng)物肝臟組織的總RNA，再經(jīng)

逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄

過(guò)程得到DNA，將其作為PCR反應(yīng)的模板，并設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物來(lái)擴(kuò)增目的基因。
（2）啟動(dòng)子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，能被

RNA聚合酶

RNA聚合酶

識(shí)別并結(jié)合，驅(qū)動(dòng)基因的

轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄

；
（3）為使phb2基因（該基因序列不含圖1中限制酶的識(shí)別序列）與載體正確連接，需在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入下列哪兩種不同限制酶的識(shí)別序列

A

A

（填選項(xiàng)）
A．EcoRⅠ和PvitⅡ
B．PvitⅡ和KpnⅠ
C．EcoRⅠ和KpnⅠ
（4）經(jīng)過(guò)這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用

T4DNA連接酶

T4DNA連接酶

（填“E.coli DNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）。
相關(guān)限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)（注：箭頭表示切割位點(diǎn)）

名稱	HindⅢ	PvitⅡ	KpnⅠ	EcoRⅠ	PstⅠ	BamHⅠ
識(shí)別序列及切割位點(diǎn)	A↓AGCTT TTCGA↑A	GAG↓CTG GTC↑GAG	G↓GTACC CCATG↑G	G↓AATTC CTTAA↑G	CTGC↓AG GA↑CGTC	G↓GATCC CCTAG↑G

（5）轉(zhuǎn)化前需用CaCl₂處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于

易接受外源DNA片段

易接受外源DNA片段

的生理狀態(tài)，以提高轉(zhuǎn)化效率。
（6）將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取菌落（分別編號(hào)為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用（2）中選用的兩種限制酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，結(jié)果如圖2，

2

2

號(hào)菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒.