現(xiàn)代生物技術(shù)
如圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒P₀具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）。請回答下列問題：

（1）EcoRV酶切位點(diǎn)為…CTA^↓TAG…，EcoRV酶切出來的DNA末端序列為

。
（2）由圖1可知氨芐青霉素抗性基因（ampr）作用是

作為標(biāo)記基因（用于篩選含有目的基因的受體細(xì)胞）

作為標(biāo)記基因（用于篩選含有目的基因的受體細(xì)胞）

。
（3）用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P₁用酶處理，在兩端各添加了一個(gè)堿基為

胸腺嘧啶（T）

胸腺嘧啶（T）

的脫氧核苷酸，形成P₂；P₂和目的基因片段在

DNA連接

DNA連接

酶作用下，形成重組質(zhì)粒P₃。
（4）為篩選出含有重組質(zhì)粒P₃的菌落，采用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長情況如表（“+”代表生長，“-”代表不生長）。根據(jù)表中結(jié)果判斷，應(yīng)選擇的菌落是

B

B

（填表中字母）類，另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是

A類菌落含有P0

A類菌落含有P0

、

C類菌落未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒

C類菌落未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒

。

菌落類型平板類型	A	B	C
無抗生素	+	+	+
氨芐青霉素	+	+	-
四環(huán)素	+	-	-
氨芐青霉素+四環(huán)素	+	-	-

PCR是體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，在基因工程中有廣泛的應(yīng)用。在進(jìn)行體外DNA擴(kuò)增時(shí)，在加熱解開DNA雙螺旋后，降溫使引物（小片段單鏈DNA）與DNA單鏈一端互補(bǔ)配對結(jié)合，而且兩個(gè)引物分別從兩端與DNA的兩條子鏈結(jié)合，在耐高溫的TaqDNA聚合酶作用下，作為子鏈合成的起點(diǎn)引導(dǎo)兩條子鏈延伸合成。循環(huán)往復(fù)就可擴(kuò)增獲得大量DNA。
（5）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的最合適的一對引物是

乙和丙

乙和丙

。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段，原因是

目的基因反向連接

目的基因反向連接

。