大腸桿菌是發(fā)酵工程常用的微生物，特定的重組大腸桿菌生產(chǎn)乳酸效率比乳酸菌更高，雜菌污染是導(dǎo)致大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵失敗的重要原因。研究人員利用基因工程獲得了相關(guān)的工程菌用于大規(guī)模生產(chǎn)乳酸。回答下列問題。
（1）如圖甲所示，大腸桿菌能以培養(yǎng)基中的葡萄糖為

碳源

碳源

，通過細(xì)胞呼吸的第一階段將其分解為

丙酮酸

丙酮酸

（物質(zhì)A），進(jìn)而發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，同時(shí)還有乙酸、琥珀酸等副產(chǎn)物。

（2）科學(xué)家利用重組片段和特定技術(shù)敲除原始菌株擬核上的F酶基因，獲得更高效的乳酸發(fā)酵工程菌，過程如圖乙。重組片段上的慶大霉素抗性基因（Gm^r）除了能替換掉擬核上的F酶基因，還起到

作為標(biāo)記基因，用于篩選出F基因敲除突變菌株

作為標(biāo)記基因，用于篩選出F基因敲除突變菌株

的作用。綜合圖甲和圖乙信息，寫出對(duì)該工程菌的進(jìn)一步改造思路（提出2點(diǎn)）：

用相同方法獲得F酶、T酶雙基因敲除菌株；實(shí)際發(fā)酵使用的菌株要將引入的Gmr去除

用相同方法獲得F酶、T酶雙基因敲除菌株；實(shí)際發(fā)酵使用的菌株要將引入的Gmr去除

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（3）研究人員利用基因工程技術(shù)，使甲酰胺酶基因和亞磷酸脫氫酶基因在大腸桿菌中同時(shí)表達(dá)，改造出一種加強(qiáng)型大腸桿菌，可以通過控制培養(yǎng)基中的氮源和磷源種類實(shí)現(xiàn)高效抑制雜菌污染的目的。
①研究人員設(shè)計(jì)引物，通過PCR分別特異性擴(kuò)增出甲酰胺酶基因和亞磷酸脫氫酶基因，PCR過程中的引物需要

4

4

種。
②構(gòu)建甲酰胺酶基因和亞磷酸脫氫酶基因融合表達(dá)載體后，導(dǎo)入表達(dá)載體前需先將大腸桿菌處理為

感受態(tài)

感受態(tài)

細(xì)胞。對(duì)照組大腸桿菌需要導(dǎo)入

空質(zhì)粒

空質(zhì)粒

。
③甲酰胺酶能催化甲酰胺生成銨鹽，亞磷酸脫氫酶能催化亞磷酸鹽生成磷酸鹽，分別可作為大腸桿菌的氮源和磷源。迄今為止，在自然界中還沒有發(fā)現(xiàn)能同時(shí)表達(dá)甲酰胺酶基因和亞磷酸脫氫酶基因的微生物。利用加強(qiáng)型大腸桿菌發(fā)酵時(shí)，能有效減少雜菌污染的原因是

大腸桿菌能利用甲酰胺和亞磷酸鹽合成自身所需要的物質(zhì)，正常生長(zhǎng)；而雜菌體內(nèi)無(wú)甲酰胺酶基因和亞磷酸脫氫酶基因，無(wú)法利用兩種物質(zhì)，所以無(wú)法生長(zhǎng)，從而不能污染大腸桿菌發(fā)酵過程

大腸桿菌能利用甲酰胺和亞磷酸鹽合成自身所需要的物質(zhì)，正常生長(zhǎng)；而雜菌體內(nèi)無(wú)甲酰胺酶基因和亞磷酸脫氫酶基因，無(wú)法利用兩種物質(zhì)，所以無(wú)法生長(zhǎng)，從而不能污染大腸桿菌發(fā)酵過程

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