環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)通過(guò)設(shè)計(jì)特定引物進(jìn)行PCR，來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)載體的單堿基突變，從而生產(chǎn)出滿足需求的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒 pUC18中含有限制酶 Eam1105Ⅰ（識(shí)別序列為5'-GACGGGAGTC-3'）和EcoRⅠ的識(shí)別序列。為使質(zhì)粒pUC18不能被限制酶Eam1105Ⅰ識(shí)別，但依然具有氨芐青霉素抗性，現(xiàn)對(duì)質(zhì)粒pUC18第1695個(gè)堿基（圖方框中的堿基）進(jìn)行誘變，設(shè)計(jì)了具有誘變位點(diǎn)的引物P1和不具有誘變位點(diǎn)的引物P₂。具體操作流程如圖所示。

（1）為使誘變后的質(zhì)粒不能被限制酶 Eaml105Ⅰ識(shí)別，但依然具有氨芐青霉素抗性，選擇質(zhì)粒突變位點(diǎn)時(shí)應(yīng)注意

誘變的位點(diǎn)位于限制酶Eam1105Ⅰ識(shí)別序列中，誘變后編碼的氨基酸不變或不影響氨芐青霉素基因的正常表達(dá)

誘變的位點(diǎn)位于限制酶Eam1105Ⅰ識(shí)別序列中，誘變后編碼的氨基酸不變或不影響氨芐青霉素基因的正常表達(dá)

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（2）進(jìn)行上述PCR反應(yīng)，緩沖液中需提供pUC18質(zhì)粒，P₁、P₂兩種引物以及

耐高溫DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸

耐高溫DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸

，同時(shí)通過(guò)控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。至少經(jīng)過(guò)

2

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個(gè)循環(huán)，會(huì)出現(xiàn)雙鏈均被誘變的線性質(zhì)粒。擴(kuò)增得到的線性質(zhì)粒需在

T₄DNA連接

T₄DNA連接

酶的作用下才能連接成環(huán)狀質(zhì)粒。
（3）提取連接產(chǎn)物（環(huán)化后的質(zhì)粒），經(jīng)過(guò) EcoRⅠ、Eaml105Ⅰ雙酶切，然后進(jìn)行電泳，可根據(jù)結(jié)果判斷質(zhì)粒pUC18的第1695個(gè)堿基誘變是否成功，判斷的理由是

誘變后質(zhì)粒的電泳圖譜中只有1條條帶，未誘變質(zhì)粒會(huì)出現(xiàn)2條條帶

誘變后質(zhì)粒的電泳圖譜中只有1條條帶，未誘變質(zhì)粒會(huì)出現(xiàn)2條條帶

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