p21蛋白是一種重要的細(xì)胞周期抑制因子，對(duì)家禽卵泡和肌肉發(fā)育、哺乳動(dòng)物卵子成熟和胚胎發(fā)育均具有重要調(diào)節(jié)作用。為研究p2l基因?qū)∪獍l(fā)育的調(diào)控機(jī)理，科研人員依據(jù)哺乳動(dòng)物的p21基因保守序列（不同物種特定基因在進(jìn)化過(guò)程中保持不變的序列）克隆了雞p21基因并開展相關(guān)研究。圖1為p21基因克隆及克隆產(chǎn)物與綠色熒光蛋白基因（GFP）構(gòu)建融合基因表達(dá)載體過(guò)程示意圖，圖2為真核生物基因轉(zhuǎn)錄示意圖。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。

（1）家禽等鳥類生物與哺乳動(dòng)物均具有序列高相似度的p21基因，從

分子

分子

水平上為生物進(jìn)化論提供了有力的證據(jù)。結(jié)合圖1過(guò)程①的結(jié)果分析，p21基因保守序列最可能位于基因的

外顯子（編碼區(qū)）

外顯子（編碼區(qū)）

部位。
（2）RNA的穩(wěn)定性較低，細(xì)胞質(zhì)中的RNA外切酶威脅著RNA的壽命。在真核細(xì)胞中，核基因經(jīng)圖2中過(guò)程②

轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄

、加工形成的成熟mRNA，其3′-端通常具有幾十到幾百個(gè)腺苷酸構(gòu)成的Poly（A）尾以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，推測(cè)Poly（A）尾的作用可能是

維持mRNA的穩(wěn)定性、引導(dǎo)mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)

維持mRNA的穩(wěn)定性、引導(dǎo)mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)

。
（3）進(jìn)行PCR1前需用TdT在cDNA的3′-端添加Poly（C）尾，原因是

便于引物的設(shè)計(jì)

便于引物的設(shè)計(jì)

；該過(guò)程中使用的TdT與DNA聚合酶在催化核苷酸鏈延伸上的差異為

TdT在催化時(shí)不需要模板

TdT在催化時(shí)不需要模板

。PCR2過(guò)程中采用的引物序列分別為

5′TTTTTT3′和5′CCGCTG3′片段

5′TTTTTT3′和5′CCGCTG3′片段

（寫出含6個(gè)堿基的序列即可）。PCR3中需要添加的物質(zhì)有dNTP、無(wú)菌水、片段1及

片段2、TaqDNA聚合酶（耐高溫的DNA聚合酶）、擴(kuò)增緩沖液（含Mg²⁺）

片段2、TaqDNA聚合酶（耐高溫的DNA聚合酶）、擴(kuò)增緩沖液（含Mg²⁺）

（至少寫出2種）等。
（4）據(jù)圖1和下表分析，為保證p21cDNA和質(zhì)粒正確連接，進(jìn)行PCR4擴(kuò)增時(shí)需要在引物的5′-端添加限制酶

BamHⅠ和HindⅢ；

BamHⅠ和HindⅢ；

的識(shí)別序列，實(shí)際操作過(guò)程中需要先對(duì)p21cDNA進(jìn)行測(cè)序分析，原因是

p21cDNA可能存在需添加的限制酶識(shí)別序列

p21cDNA可能存在需添加的限制酶識(shí)別序列

。
限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)

EcoRⅠ	BamHⅠ	HindⅢ	Sau3AⅠ	BclⅠ
G↓AATTC	G↓GATCC	A↓AGCTT	↓GATC	T↓GATCA

（5）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入肌肉細(xì)胞常采用

顯微注射

顯微注射

法，體外培養(yǎng)肌肉細(xì)胞時(shí)可通過(guò)觀察

綠色熒光分布

綠色熒光分布

初步分析p21蛋白在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)過(guò)程的作用位置，為進(jìn)一步分析提供參考。