利用基因工程技術(shù)培育出油脂高產(chǎn)的四尾柵藻，是獲取生物柴油的新途徑。科學(xué)家欲從紫蘇中提取DGAT1基因（催化油脂合成的關(guān)鍵酶基因），導(dǎo)入到四尾柵藻細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因油脂高產(chǎn)的四尾柵藻，流程如圖1。質(zhì)粒pCAMBIA與PCR擴(kuò)增出的DGAT1酶切位點(diǎn)如圖所示。現(xiàn)有BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ三種限制酶，它們識(shí)別并切割的堿基序列如表，

BamHI	5'-G，GATCC-3
BglⅡ	5'-A↓GATCT-3
EcoR I	5'-GAATTC-3

（1）從紫蘇組織細(xì)胞中提取總RNA時(shí)，需要加入RNA酶抑制劑，目的是

防止RNA酶降解RNA

防止RNA酶降解RNA

。過程①需要

逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄

酶的催化，過程②通過PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)，進(jìn)行PCR時(shí)，需要在兩種引物的5'端添加限制酶

BglⅡ

BglⅡ

的識(shí)別序列。
（2）啟動(dòng)子往往具有物種特異性，在載體pCAMBIA質(zhì)粒中插入紫蘇DGAT1基因，其上游啟動(dòng)子應(yīng)選擇

四尾柵藻

四尾柵藻

（填“紫蘇DGAT1基因”、“大腸桿菌”或“四尾柵藻”）啟動(dòng)子。
（3）將DGAT1與pCAMBIA分別用限制酶切割后進(jìn)行連接可形成重組質(zhì)粒，目的基因和質(zhì)粒能連接成重組質(zhì)粒的原因是

有相同的黏性末端可發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)

有相同的黏性末端可發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)

。
若只考慮DNA片段的兩兩連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)可得到

3

3

種大小不同的連接產(chǎn)物。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后，可向培養(yǎng)基中加入

卡那霉素

卡那霉素

篩選出導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌。
（4）為進(jìn)一步篩選出符合要求的重組質(zhì)粒，選用

EcoRⅠ

EcoRⅠ

限制酶對(duì)不同的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切處理，得到的電泳結(jié)果如圖2所示，其中

A

A

組重組質(zhì)粒為所需質(zhì)粒。（已知質(zhì)粒pCAMBIA中EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)與BamHI的酶切位點(diǎn)間的最短距離為600bp）
（5）轉(zhuǎn)DGAT1基因四尾柵藻成功的標(biāo)志是

轉(zhuǎn)基因四尾柵藻成功表達(dá)出了DGATI基因控制的蛋白質(zhì)

轉(zhuǎn)基因四尾柵藻成功表達(dá)出了DGATI基因控制的蛋白質(zhì)

。