產黃青霉是青霉素工業(yè)生產的常用菌，利用誘變育種和基因工程育種方法獲得高產菌并進行發(fā)酵生產?；卮鹣铝袉栴}：
（一）菌種的選育及保存。
（二）發(fā)酵過程及產物分離純化。發(fā)酵流程為：活化培養(yǎng)→一級種子罐→二級種子罐→發(fā)酵罐（發(fā)酵）→放罐。
（1）誘變育種。在山梨醇溶液中用酶水解產黃青霉細胞壁，得到原生質體，推測山梨醇溶液的作用是

維持滲透壓，防止原生質體被破壞

維持滲透壓，防止原生質體被破壞

。用15W的紫外線在距離培養(yǎng)瓶20cm處照射產黃青霉原生質體，誘發(fā)其發(fā)生變異。為檢測是否發(fā)生變異，可利用顯微鏡觀察其細胞核中染色體

結構和數目

結構和數目

變化，也可以接種到固體培養(yǎng)基上，經培養(yǎng)后觀察

菌落形態(tài)

菌落形態(tài)

變化。
（2）基因工程育種。
①將產黃青霉涂布于三種抗生素的一系列不同濃度的平板上，在26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時，研究菌落生長情況。結果發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素濃度達250μL/mL，菌落數開始減少，氯霉素濃度高達500μL/mL，菌落仍然能正常生長，10μL/mL腐草霉素足以抑制菌落生長。據此推測，應該選用

腐草霉素抗性

腐草霉素抗性

基因作為篩選標記基因。
②獲得促進產黃青霉大量合成青霉素的目的基因，經PCR擴增后，連接到真菌表達載體上，真菌表達載體上除了有標記基因、復制起點還有

啟動子和終止子

啟動子和終止子

，使目的基因得以表達。
③利用PEG介導的原生質體轉化法將表達載體導入產黃青霉原生質體。影響轉化效率的因素除表達載體的大小和數量、PEG濃度及外界因素外，還有

原生質體數量、原生質體生理狀態(tài)、PEC作用時間

原生質體數量、原生質體生理狀態(tài)、PEC作用時間

等（寫出2點）。
（3）菌種保存。以上兩種方法篩選得到的高產菌，一般通過制備繁殖體孢子，利用真空干燥，低溫長期保存。采用孢子保存而不直接保存菌絲的原因是

孢子處于休眠狀態(tài)，不易突變

孢子處于休眠狀態(tài)，不易突變

。
（4）發(fā)酵條件的控制：產黃青霉菌絲生長溫度為27℃左右，分泌青霉素溫度為20℃左右。所以種子罐的溫度一般要比發(fā)酵罐的

高

高

。產黃青霉培養(yǎng)基的pH應控制為

中性偏酸

中性偏酸

，增加培養(yǎng)基中溶氧量的方法有控制通入無菌空氣的速度和控制

攪拌

攪拌

速度。發(fā)酵過程會產生泡沫，需要用消沫劑除去泡沫，以提高發(fā)酵效率。下列哪些因素會使發(fā)酵液產生的泡沫增多？

ABCD

ABCD

。
A．發(fā)酵菌細胞呼吸產氣增多
B．加速攪拌發(fā)酵液
C．通氣增多
D．培養(yǎng)基黏度高
（5）產物的分離純化：發(fā)酵過程結束后，可通過

離心或過濾

離心或過濾

得到發(fā)酵液，加少量絮凝劑沉淀蛋白后，根據青霉素易溶于有機溶劑的特性，可采用

萃取

萃取

的方法進一步分離純化。