番茄的果實營養(yǎng)豐富，具特殊風味，是深受人們喜愛的蔬果，但番茄不抗凍，在我國冬季無法栽培?，F(xiàn)有科研人員利用轉基因技術，將北極海魚中的抗凍基因轉入到了番茄細胞中，從而培育成功抗凍番茄。導入目的基因的方法是農(nóng)桿菌轉化法，圖1為培育過程使用的Ti質(zhì)粒，已知Vir區(qū)的基因活化能促進T-DNA的加工和轉移?；卮鹣铝袉栴}：

（1）若經(jīng)過誘變，北極海魚的一條染色體上的抗凍基因發(fā)生了堿基對的替換，導致抗凍能力大大增強，通過瓊脂糖凝膠電泳，能否區(qū)分突變前后的兩個抗凍基因？

不能

不能

，請說明理由

因為堿基對的替換，突變前后基因長度相同，無法通過瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分

因為堿基對的替換，突變前后基因長度相同，無法通過瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分

。
（2）對于目的基因的獲取，研究人員提取了抗凍蛋白，根據(jù)氨基酸序列分析了mRNA的堿基序列，繼而合成了抗凍基因，通過這種方法得到的目的基因因不含

復制起點

復制起點

、

啟動子和終止子

啟動子和終止子

，故無法擴增和表達。選擇圖示Ti質(zhì)粒構建基因表達載體，應選擇限制酶

Ⅲ

Ⅲ

（填“Ⅰ”或“Ⅱ”或“Ⅲ”），不選其它限制酶的理由是

限制酶Ⅰ會破壞四環(huán)素抗性基因，影響后續(xù)含目的基因的受體細胞的篩選，限制酶Ⅱ會破壞Vir區(qū)基因，影響目的基因的轉移

限制酶Ⅰ會破壞四環(huán)素抗性基因，影響后續(xù)含目的基因的受體細胞的篩選，限制酶Ⅱ會破壞Vir區(qū)基因，影響目的基因的轉移

。
（3）為篩選成功導入抗凍基因的番茄細胞，在培養(yǎng)基中添加

四環(huán)素

四環(huán)素

。將篩選后獲得的番茄細胞經(jīng)

脫分化

脫分化

過程形成愈傷組織后，經(jīng)器官發(fā)生途徑或

體細胞胚發(fā)生

體細胞胚發(fā)生

途徑發(fā)育形成植株，再在

低溫/寒冷

低溫/寒冷

條件下篩選出具有抗凍性狀的番茄植株。
（4）研究人員想比較不同轉基因番茄中抗凍蛋白的合成量，制備相應的單克隆抗體，利用圖2所示原理進行檢測。
①檢測前，先將抗凍蛋白的單克隆抗體固定在支持物上，然后向該檢測體系中加入一定量的番茄植株中提取的蛋白質(zhì)（待測抗原）和等量酶標記抗凍蛋白（酶標記抗原），目的是讓待測抗原、酶標記抗原與抗體

競爭性

競爭性

結合。
②保溫一段時間后洗滌，再向檢測體系中加入一定量的白色底物，若檢測體系藍色越

淺

淺

，則說明番茄提取物中抗凍蛋白的含量越高。
③本檢測方法中的單克隆抗體可經(jīng)雜交瘤細胞體外培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔克隆化培養(yǎng)后，分別從

細胞培養(yǎng)液

細胞培養(yǎng)液

、

小鼠腹水

小鼠腹水

中提取。