真菌AFPs基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能提高細(xì)胞的抗凍能力，將AFPs基因?qū)敕阎信嘤箖龇哑贩N，能延長番茄果實的儲存期?？蒲腥藛T通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出超量表達(dá)AFPs基因的轉(zhuǎn)基因番茄。在超量表達(dá)AFPs基因載體的構(gòu)建中，含AFPs基因的DNA片段以及基因表達(dá)載體的元件組成情況如圖所示，其中強啟動子能驅(qū)動基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄，M基因會影響AFPs基因的表達(dá)效果。
?
（1）利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增可得到大量的AFPs基因，PCR擴(kuò)增目的基因時，設(shè)計的引物只能與模板鏈在3'端配對，其原因是

DNA聚合酶只能從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸

DNA聚合酶只能從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸

。
（2）為獲得能正確表達(dá)的重組質(zhì)粒，應(yīng)分別使用哪些限制酶對質(zhì)粒、含強啟動子和AFPs基因的DNA片段進(jìn)行切割：

BamHⅠ、XhoⅠ

BamHⅠ、XhoⅠ

、

BamHⅠ、SalⅠ

BamHⅠ、SalⅠ

。
（3）已知基因表達(dá)載體乙的長度為6.7Kb,M基因片段長度為0.6kb,強啟動子+AFPs基因片段的長度為2.8kb,推測表達(dá)載體甲的長度約為

4.5

4.5

kb。
（4）抗凍相關(guān)基因超量表達(dá)依賴于適宜的啟動子。啟動子可分為組成型啟動子（每種組織器官中均發(fā)揮作用）、組織特異型啟動子（特定組織器官中才能發(fā)揮作用）和誘導(dǎo)型啟動子（特定條件刺激下才能發(fā)揮作用），構(gòu)建基因表達(dá)載體時可單獨使用某一類型的啟動子，也可組合使用多種類型的啟動子。從減少物質(zhì)和能量消耗的角度出發(fā)，最好選擇

誘導(dǎo)型啟動子

誘導(dǎo)型啟動子

，使番茄果實在寒冷刺激下才啟動抗寒基因的表達(dá)。
（5）對轉(zhuǎn)基因番茄植株進(jìn)行鑒定時發(fā)現(xiàn)，有些植株雖有AFPs基因，但幾乎沒有AFPs蛋白，造成該現(xiàn)象的原因可能有

基因轉(zhuǎn)化過程中強啟動子可能丟失或斷裂，未能真正轉(zhuǎn)化成功；雖然轉(zhuǎn)化成功，但是AFPs基因保持沉默，不能有效表達(dá)

基因轉(zhuǎn)化過程中強啟動子可能丟失或斷裂，未能真正轉(zhuǎn)化成功；雖然轉(zhuǎn)化成功，但是AFPs基因保持沉默，不能有效表達(dá)

。（答出2項即可）