TGF-β信號(hào)通路可通過(guò)S蛋白去磷酸化抑制癌細(xì)胞增殖。該過(guò)程中N蛋白磷酸化后被激活，可使S蛋白發(fā)生磷酸化；藥物SPD可通過(guò)影響R蛋白來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)TGFβ信號(hào)通路的響應(yīng)。為探索藥物SPD治療癌癥的機(jī)理，需構(gòu)建基因表達(dá)載體以獲得融合蛋白S-HA、N-HA和R-HA。HA是一種短肽，連接在S、N或R蛋白的羧基端 （不影響S、N或R的功能），細(xì)胞中只有帶HA標(biāo)簽的融合蛋白能與介質(zhì)上的HA抗體結(jié)合，從而分離得到HA標(biāo)簽融合蛋白。
（1）若將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白，在對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)應(yīng)以 

cDNA

cDNA

（填“基因組DNA”或“cDNA”） 為模板。
（2）用于PCR擴(kuò)增S基因的引物5'端分別加入了限制酶NheⅠ和HindⅢ的識(shí)別序列，將擴(kuò)增后的S基因插入載體上，構(gòu)建S-HA融合基因的表達(dá)載體，如圖1所示，其中“TACCCAT”是HA編碼鏈的起始序列。將重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，表達(dá)的蛋白有S蛋白的氨基酸序列但沒(méi)有HA的氨基酸序列，據(jù)圖1分析，出現(xiàn)該問(wèn)題的原因是 

PCR擴(kuò)增時(shí)未在引物上將S基因編碼終止密碼子的TGA刪除，導(dǎo)致融合基因翻譯提前終止，未表達(dá)出HA的氨基酸序列

PCR擴(kuò)增時(shí)未在引物上將S基因編碼終止密碼子的TGA刪除，導(dǎo)致融合基因翻譯提前終止，未表達(dá)出HA的氨基酸序列

。該問(wèn)題解決后將重組載體再次導(dǎo)入細(xì)胞，表達(dá)出了融合蛋白，卻無(wú)法分離得到，據(jù)圖1分析，可能的原因是

HA編碼序列的第一個(gè)堿基與HA序列前的載體的最后兩個(gè)堿基編碼一個(gè)氨基酸，導(dǎo)致HA的mRNA的密碼子被錯(cuò)誤讀取

HA編碼序列的第一個(gè)堿基與HA序列前的載體的最后兩個(gè)堿基編碼一個(gè)氨基酸，導(dǎo)致HA的mRNA的密碼子被錯(cuò)誤讀取

。

（3）融合蛋白表達(dá)成功并分離得到R-HA和磷酸化的S-HA、N-HA。將三種融合蛋白按照?qǐng)D2所示的組合方式分別在緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)S-HA和N-HA的磷酸化水平，結(jié)果如圖2所示，推測(cè)R蛋白的作用是

R蛋白對(duì)S蛋白和N蛋白去磷酸化

R蛋白對(duì)S蛋白和N蛋白去磷酸化

。向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度SPD處理相同時(shí)間，通過(guò)電泳檢測(cè)細(xì)胞中R蛋白水平，結(jié)果如圖3所示，推測(cè)SPD對(duì)R蛋白的影響是 

SPD可促進(jìn)R蛋白的表達(dá)

SPD可促進(jìn)R蛋白的表達(dá)

。
（4）據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，藥物SPD治療癌癥的機(jī)理是

一方面，SPD通過(guò)促進(jìn)R蛋白表達(dá)，對(duì)N蛋白去磷酸化后間接降低S蛋白的磷酸化水平，從而抑制癌細(xì)胞的增殖；另一方面，SPD通過(guò)促進(jìn)R蛋白表達(dá)對(duì)S蛋白去磷酸化，直接降低S蛋白的磷酸化水平，從而抑制癌細(xì)胞的增殖

一方面，SPD通過(guò)促進(jìn)R蛋白表達(dá)，對(duì)N蛋白去磷酸化后間接降低S蛋白的磷酸化水平，從而抑制癌細(xì)胞的增殖；另一方面，SPD通過(guò)促進(jìn)R蛋白表達(dá)對(duì)S蛋白去磷酸化，直接降低S蛋白的磷酸化水平，從而抑制癌細(xì)胞的增殖

。