糖化酶是將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的酶，大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人員將經(jīng)誘變處理后獲取的黑曲霉菌高產(chǎn)糖化酶基因?qū)氘叧嘟湍窩S115（對(duì)氨芐青霉素不敏感）中，構(gòu)建能直接利用淀粉的工程菌，該過(guò)程所用質(zhì)粒（僅示部分結(jié)構(gòu)）如圖1所示。質(zhì)粒的外側(cè)鏈為a鏈，內(nèi)側(cè)鏈為b鏈?；駻mp^r轉(zhuǎn)錄的模板鏈屬于b鏈的片段。三種限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見(jiàn)下表。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。

限制酶	BamHⅠ	PstⅠ	XbaⅠ
識(shí)別序列和切割位點(diǎn)（5′→3′）	G↓GATCC	C↓TGCAG	T↓CTAGA

（1）為獲得糖化酶高產(chǎn)菌株，研究人員將經(jīng)誘變處理后的黑曲霉菌接種到

淀粉

淀粉

含量高的培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)適宜時(shí)間后滴加碘液，挑選出透明圈（不產(chǎn)生藍(lán)色）直徑

較大

較大

的菌株，再進(jìn)行復(fù)篩以及穩(wěn)定性遺傳實(shí)驗(yàn)。
（2）質(zhì)粒復(fù)制的模板鏈?zhǔn)?

a和b

a和b

（選填“a”、“b”、“a和b”、“a或b”）鏈。高產(chǎn)糖化酶基因插入質(zhì)粒后，其轉(zhuǎn)錄的模板鏈屬于

a

a

鏈的片段。
（3）構(gòu)建高產(chǎn)糖化酶基因表達(dá)載體時(shí)，使用限制酶切割pPIC9K，37℃，15min后需將溫度升高至65℃并保溫20min,目的是使

限制酶失活

限制酶失活

，從而終止酶切反應(yīng)。圖2是高產(chǎn)糖化酶基因示意圖（僅示部分堿基），為使其能定向插入表達(dá)載體并成功表達(dá)，則PCR擴(kuò)增時(shí)引物的堿基序列為

①④

①④

。
①5′-TCTAGATCTGTTGAAT-3′②5′-TCTAGAAGACAACTTA-3′
③5′-CTGCAGCTTGGATGAT-3′④5′-GGATCCCTTGGATGAT-3′
⑤5′-GGATCCGAACCTACTA-3′⑥5′-CTCGAGTCTGTTGAAT-3′
（4）畢赤酵母GS115是一種組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型微生物，自身不能合成生長(zhǎng)必需的組氨酸，因此可利用

不含組氨酸

不含組氨酸

的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不含淀粉）初步篩選導(dǎo)入高產(chǎn)糖化酶基因表達(dá)載體的畢赤酵母GS115，再將篩選出的細(xì)胞轉(zhuǎn)接至含甲醇的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶性能測(cè)定。