金屬硫蛋白（Metallothionein,MT）是由動(dòng)植物和微生物產(chǎn)生的一類(lèi)低分子量、富含半胱氨酸、具有金屬結(jié)合能力的多肽，具有多種生物學(xué)功能。近年來(lái)，因其具有與Zn、Cu、Cd等重金屬的較強(qiáng)結(jié)合能力，而用于生態(tài)修復(fù)?？蒲腥藛T成功地將人MT蛋白基因用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入番茄，成功培育轉(zhuǎn)基因番茄?；卮鹣铝袉?wèn)題：

（1）感受態(tài)農(nóng)桿菌的制備：取保存的根癌農(nóng)桿菌菌落用

接種環(huán)

接種環(huán)

接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，并置于

搖床

搖床

中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，完成菌種的活化和擴(kuò)大培養(yǎng)；取適量菌液置于低濃度、

低溫

低溫

的CaCl₂溶液中處理，制得感受態(tài)農(nóng)桿菌。
（2）MT目的基因的獲取和轉(zhuǎn)化：取人肝臟細(xì)胞破碎后提取mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成cDNA，經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增后的產(chǎn)物分別與Ti質(zhì)粒連接形成重組質(zhì)粒（如圖），將其與制備好的感受態(tài)農(nóng)桿菌混合，最后進(jìn)行短暫的

熱刺激

熱刺激

處理，使外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞；經(jīng)適宜條件培養(yǎng)一段時(shí)間，再加入適宜濃度的 

卡那霉素

卡那霉素

篩選出轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌。
（3）轉(zhuǎn)化番茄：取番茄子葉進(jìn)行

消毒

消毒

處理后切段，再與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行共培養(yǎng)適宜時(shí)間，取出子葉放在

無(wú)菌濾紙

無(wú)菌濾紙

上吸取多余菌液，再將子葉放在適宜的以

MS

MS

培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配制的培養(yǎng)基中進(jìn)行活化和除菌培養(yǎng)。
（4）育成轉(zhuǎn)基因番茄：取上述處理的番茄子葉先經(jīng)

脫分化

脫分化

過(guò)程形成愈傷組織，再經(jīng)發(fā)芽和生根，最后經(jīng)過(guò)

煉苗和移栽

煉苗和移栽

過(guò)程，育成成熟的番茄植株。
（5）轉(zhuǎn)基因番茄性狀的檢測(cè)和生產(chǎn)應(yīng)用：為了檢測(cè)番茄中是否成功導(dǎo)入目的基因，可依據(jù)

T-DNA片段的（部分）序列

T-DNA片段的（部分）序列

設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)的同時(shí)應(yīng)以

未導(dǎo)入質(zhì)粒的野生型番茄

未導(dǎo)入質(zhì)粒的野生型番茄

作為陰性對(duì)照，以農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的番茄作為陽(yáng)性對(duì)照；已知某轉(zhuǎn)基因番茄植物能大量吸收Z(yǔ)n、Cd等元素，且主要富集在根，生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)需對(duì)其定期拔除并實(shí)施無(wú)害處理，原因是

避免死亡后根等遺體被分解，鋅再度返回土壤，造成二次污染；及時(shí)拔除植物后，緩解鋅隨食物鏈不斷富集的危害

避免死亡后根等遺體被分解，鋅再度返回土壤，造成二次污染；及時(shí)拔除植物后，緩解鋅隨食物鏈不斷富集的危害

（答出2點(diǎn)即可）。