phb2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動物phb2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡稱phb2基因），大小為0.9kb（1kb=1000堿基對），利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白。下圖1是phb2基因編碼區(qū)序列以及兩端需添加的能被相關(guān)酶識別的序列，圖2為研究所用表達(dá)載體示意圖，表格為有關(guān)的限制酶種類及識別序列和切割位點(diǎn)?；卮鹣铝袉栴}。

限制酶種類	SpeⅠ	PvitⅡ	BamHⅠ	XbaⅠ
識別序列	5'A↓CTAGT3'	5'CAG↓CTG3'	5'G↓GATCC3'	5'T↓CTAGA3'

（1）用PCR擴(kuò)增phb2基因時，為了使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，以便構(gòu)建基因表達(dá)載體，可以考慮在引物的

5'端

5'端

（填“3'端”或“5'端”）添加限制酶識別序列。據(jù)圖可推斷，擴(kuò)增α鏈時需添加的限制酶識別序列以及所用引物的堿基序列是

5'CAGCTGTCATTT3'

5'CAGCTGTCATTT3'

（寫出12個堿基并注明方向）。經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時，可選用

T₄DNA連接酶

T₄DNA連接酶

（填“E。coliDNA連接酶”或“T₄DNA連接酶”）。
（2）構(gòu)建的基因表達(dá)載體中需要使用大腸桿菌蛋白基因的啟動子tac,其原因是

tac有利于目的基因在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

tac有利于目的基因在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

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（3）將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含

氨芐青霉素

氨芐青霉素

的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取菌落（分別編號為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用（1）中選用的兩種限制酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，結(jié)果如圖3，

3

3

號菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。
注：M為指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物；小于0.2kb的DNA分子條帶未出現(xiàn)在圖中。
（4）在篩選出成功導(dǎo)入phb2基因的大腸桿菌后，經(jīng)多代培養(yǎng)仍能提取出phb2基因，你認(rèn)為phb2基因是否已成功轉(zhuǎn)化？你的觀點(diǎn)及理由是

不一定，轉(zhuǎn)化是指目的基因成功導(dǎo)入受體細(xì)胞并穩(wěn)定存在和表達(dá)，僅提取到phb2目的基因不能說明它能否正常表達(dá)

不一定，轉(zhuǎn)化是指目的基因成功導(dǎo)入受體細(xì)胞并穩(wěn)定存在和表達(dá)，僅提取到phb2目的基因不能說明它能否正常表達(dá)

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