人胰島素基因表達(dá)的最初產(chǎn)物是一條肽鏈構(gòu)成的胰島素原，切除部分肽段（C肽段）后形成成熟的胰島素，如圖1所示?？茖W(xué)家據(jù)此提出了利用基因工程改造的大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素的兩種方法：AB法是根據(jù)胰島素A、B兩條肽鏈的氨基酸序列人工合成兩種DNA片段，利用工程菌分別合成兩條肽鏈后將其混合自然形成胰島素；BCA法是利用胰島B細(xì)胞中的mRNA得到胰島素基因，表達(dá)出胰島素原后再用特定酶切掉C肽段。這兩種方法使用同一種質(zhì)粒作為載體。利用基因工程生產(chǎn)人胰島素的關(guān)鍵步驟是目的基因的獲取和表達(dá)載體的構(gòu)建。

（1）由于密碼子具有

簡并

簡并

性，AB法中人工合成的兩種DNA片段均有多種可能的序列。獲取的目的基因中不含人胰島素基因啟動子的方法是

AB和BCA

AB和BCA

（填“AB”或“BCA”或“AB和BCA”）法。
（2）圖2是利用基因工程生產(chǎn)人胰島素過程中使用的質(zhì)粒及目的基因的部分結(jié)構(gòu)。為使目的基因與載體正確連接，在設(shè)計PCR引物時可添加限制酶

XhoⅠ和MunⅠ

XhoⅠ和MunⅠ

的識別序列。通過添加保護(hù)堿基序列可以延長限制酶識別序列一端的堿基數(shù)，從而提高限制酶識別及切割的效率，保護(hù)堿基序列應(yīng)添加在限制酶識別序列的

5'

5'

（填“3'”或“5'”）端。
根據(jù)上述信息，從以下序列中選擇出適合的上游引物（GGG是保護(hù)堿基序列）：

c

c

。
a：5'-GTAGTCGAACAATTGGGG-3'e：5'-CTCGAGGGGATGCCAATC-3'
b：5'-CAATTGGGGGTAGTCGAA-3'f：5'-GGGCAATTGGTAGTCGAA-3'
c：5'-GGGCTCGAGATGCCAATC-3'g：5'-ATGCCAATCGGGCTCGAG-3'
d：5'-ATGCCAATCCTCGAGGGG-3'h：5'-GTAGTCGAAGGGCAATTG-3
（3）β-半乳糖苷酶可以分解無色的Xgal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌時，在添加了氨芐青霉素和X-gal的培養(yǎng)基上應(yīng)選擇白色的菌落，原因是

因為目的基因的插入破壞了 lacZ 基因的結(jié)構(gòu)，使其不能正常表達(dá)產(chǎn)生 β-半乳糖苷酶，底物 X-gal 不會被分解（未導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌無法在添加了氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長）

因為目的基因的插入破壞了 lacZ 基因的結(jié)構(gòu)，使其不能正常表達(dá)產(chǎn)生 β-半乳糖苷酶，底物 X-gal 不會被分解（未導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌無法在添加了氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長）

。
（4）經(jīng)測算BCA法的成本顯著低于AB法，根據(jù)這兩種方法的差異分析可能的原因是

①人工合成目的基因的成本高于反轉(zhuǎn)錄 PCR 合成目的基因；②利用工程菌表達(dá)兩條肽鏈的成本高于表達(dá)一條肽鏈；③兩條肽鏈連接形成胰島素的效率低于一條肽鏈酶切形成胰島素的效率

①人工合成目的基因的成本高于反轉(zhuǎn)錄 PCR 合成目的基因；②利用工程菌表達(dá)兩條肽鏈的成本高于表達(dá)一條肽鏈；③兩條肽鏈連接形成胰島素的效率低于一條肽鏈酶切形成胰島素的效率

。（答1點即可）