甜柿鮮果肉中含有可溶性糖、微量元素、維生素和β-胡蘿卜素等多種成分，營養(yǎng)價值高，深受消費者的喜愛。甜柿的自然脫澀與乙醛代謝關(guān)鍵酶基因（PDC）密切相關(guān)，推測澀味程度可能與PDC基因的表達情況有關(guān)。為篩選PDC基因的調(diào)控蛋白，科研人員進行了下列實驗?；卮鹣铝袉栴}。

（1）啟動子位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點，同時啟動子區(qū)域存在著許多調(diào)控蛋白的結(jié)合位點，RNA聚合酶和調(diào)控蛋白共同影響了基因的

轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄

水平。
（2）PDC基因的啟動子序列未知，為獲得大量該基因啟動子所在片段，可利用限制酶將基因組DNA進行酶切，然后在

DNA連接酶

DNA連接酶

的作用下將已知序列信息的接頭片段連接在PDC基因的上游，根據(jù)接頭片段和PDC基因編碼序列設(shè)計引物進行

PCR

PCR

擴增，在擴增過程中使用的酶稱為

Taq酶

Taq酶

，在該酶的作用下可以將4種脫氧核苷酸加到引物的一端。
（3）AD基因表達出的AD蛋白與啟動子足夠靠近時，能夠激活后續(xù)基因轉(zhuǎn)錄，據(jù)此可利用與AD蛋白形成的融合蛋白來篩選待測蛋白。利用質(zhì)粒A構(gòu)建含有PDC基因啟動子片段的重組質(zhì)粒并導入代謝缺陷型酵母菌，用不含

尿嘧啶

尿嘧啶

的培養(yǎng)基可篩選出成功轉(zhuǎn)化的酵母菌Y1H；將從甜柿中提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄形成的各種cDNA與質(zhì)粒G連接后導入酵母菌，此時應(yīng)選擇質(zhì)粒G中的位點

2

2

（填序號1～5）作為cDNA的插入位點，最終獲得攜帶不同cDNA片段的酵母菌群Y187。
（4）重組酵母Y1H與Y187能夠進行接合生殖，形成的接合子含有兩種酵母菌質(zhì)粒上的所有基因。若接合子能在含有

金擔子素

金擔子素

的培養(yǎng)基中生存，則推測待測蛋白是PDC基因的調(diào)控蛋白。