人體肝臟細(xì)胞中的乙醛脫氫酶2（ALDH2）是人體酒精代謝中的關(guān)鍵酶。研究人員利用定點(diǎn)誘變技術(shù)對(duì)ALDH2基因進(jìn)行改造后在大腸桿菌中表達(dá)，獲得具有較好溶解性的乙醛脫氫酶2。所用質(zhì)粒和操作過(guò)程如圖。其中，Amp^r為氨芐青霉素抗性基因，Tet^r為四環(huán)素抗性基因。質(zhì)粒的外側(cè)鏈為a鏈，內(nèi)側(cè)鏈為b鏈。基因Tet^r轉(zhuǎn)錄的模板鏈屬于b鏈的片段。改造后的ALDH2基因編碼區(qū)首端到末端（其中一條鏈）的序列為5'-ATCCATGCGCTC…（中間核苷酸序列）CAGTGAGTAGCG-3'。四種限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見(jiàn)表。

限制酶	BamHⅠ	PstⅠ	XhoⅠ	XbaⅠ
識(shí)別序列和切割位點(diǎn)（5'→3'）	G↓GATCC	C↓TGCAG	C↓TCGAG	T↓CTAGA

（1）通過(guò)定點(diǎn)誘變技術(shù)可制備自然界原本

不存在

不存在

（選填“存在”或“不存在”）的蛋白質(zhì)。
（2）基因Amp'轉(zhuǎn)錄的模板鏈屬于

a

a

鏈的片段，質(zhì)粒復(fù)制的模板鏈?zhǔn)?

a和b

a和b

鏈。
（3）過(guò)程②需要的限制酶是

BamHⅠ、XbaⅠ

BamHⅠ、XbaⅠ

，選擇依據(jù)是

Tet^r（四環(huán)素抗性基因）中存在PstⅠ和XhoI的識(shí)別序列，會(huì)將Tet^r切斷，導(dǎo)致大腸桿菌不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上存活；選擇BamHⅠ和XbaⅠ兩種酶切能避免質(zhì)粒、目的基因自身環(huán)化且實(shí)現(xiàn)目的基因定向拼接

Tet^r（四環(huán)素抗性基因）中存在PstⅠ和XhoI的識(shí)別序列，會(huì)將Tet^r切斷，導(dǎo)致大腸桿菌不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上存活；選擇BamHⅠ和XbaⅠ兩種酶切能避免質(zhì)粒、目的基因自身環(huán)化且實(shí)現(xiàn)目的基因定向拼接

。過(guò)程③常采用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理以提高操作效果。經(jīng)過(guò)程④，在培養(yǎng)基上能形成菌落的大腸桿菌類型有

導(dǎo)入空白質(zhì)粒和導(dǎo)入重組質(zhì)粒兩種類型

導(dǎo)入空白質(zhì)粒和導(dǎo)入重組質(zhì)粒兩種類型

。
（4）為擴(kuò)增上圖中改造的ALDH2基因，某同學(xué)設(shè)計(jì)了如下六種PCR引物，其中可選用（符合題意）的一對(duì)引物是

①⑤

①⑤

（選填數(shù)字序號(hào)）。根據(jù)選定的引物，經(jīng)過(guò)4次循環(huán)，最多可獲得

8

8

個(gè)符合要求的目的基因。
①5'-TCTAGACGCTACTCACTG-3'
②5'-TCTAGAATCCATGCGCTC-3'
③5'-CTGCAGATCCATGCGCTC-3'
④5'-GGATCCCGCTACTCACTG-3'
⑤5'-GGATCCATCCATGCGCTC-3'
⑥5'-CTCGAGCGCTACTCACTG-3'