枯草芽孢桿菌分泌可降解纖維素的一種酶，這種酶由W基因編碼?，F(xiàn)需在大腸桿菌中表達(dá)W基因。圖1為所使用質(zhì)粒，圖2為擴(kuò)增得到的含W基因的DNA片段，圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。W基因以乙鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA自身延伸的方向?yàn)?'→3'。如表是幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)。回答下列問(wèn)題：

限制酶	EcoRⅠ	BamHⅠ	KpmⅠ	MfeⅠ	HindⅢ
識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)	5′-G↓AATTC-3′ 3′-CTTAA↑G-5′	5′-G↓GATCC-3 3′CCTAG↓G-5	5′-GGTAC↓C-3′ 3′-C↑CATGG-5	5′-C↓AATTG-3′ 3′-GTTAA↑C-5′	3′-A↓AGCTT-5′ 3′-TTCGA↑A-5′

（1）通過(guò)PCR擴(kuò)增W基因時(shí)，要依據(jù)

目的基因兩端的堿基序列

目的基因兩端的堿基序列

設(shè)計(jì)引物；構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，除了使用限制酶，還會(huì)用到

DNA連接

DNA連接

酶。
（2）研究人員分別使用限制酶MfeⅠ、HindⅢ切割圖1中質(zhì)粒，使用限制酶EcoRⅠ、HindⅢ切割圖2中含W基因的DNA片段，獲得W基因時(shí)不使用限制酶MfeⅠ的原因是

W基因內(nèi)有MfeⅠ的識(shí)別位點(diǎn)，使用MfeⅠ會(huì)破壞W基因

W基因內(nèi)有MfeⅠ的識(shí)別位點(diǎn)，使用MfeⅠ會(huì)破壞W基因

，切割質(zhì)粒時(shí)，用MfeⅠ替換EcoRⅠ的原因有

限制酶EcoRⅠ和MfeⅠ酶切以后產(chǎn)生互補(bǔ)的黏性末端

限制酶EcoRⅠ和MfeⅠ酶切以后產(chǎn)生互補(bǔ)的黏性末端

和使用EcoRⅠ無(wú)法使目的基因插入到啟動(dòng)子與終止子之間。
（3）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞時(shí)，需要先使用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，使用含抗生素

氨芐青霉素

氨芐青霉素

的培養(yǎng)基篩選，以得到轉(zhuǎn)入W基因的大腸桿菌。