酯酶結(jié)合熒光分析法可對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)，某研究院利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得一種催化效率高、農(nóng)藥敏感性強(qiáng)的微生物酯酶，圖甲是此基因工程操作時(shí)用到的質(zhì)粒，其中不同數(shù)字代表不同的限制酶切點(diǎn)，回答下列問(wèn)題：

（1）基因工程的核心操作是

基因表達(dá)載體的構(gòu)建

基因表達(dá)載體的構(gòu)建

。在此核心操作過(guò)程中應(yīng)選用

1和3

1和3

（填圖中數(shù)字）兩種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，選用兩種酶而不選擇一種酶進(jìn)行切割的目的是

避免目的基因及質(zhì)粒自連、避免目的基因反接

避免目的基因及質(zhì)粒自連、避免目的基因反接

。除圖示外，該質(zhì)粒若作為載體還必須具有的結(jié)構(gòu)

復(fù)制原點(diǎn)

復(fù)制原點(diǎn)

。
（2）人工合成酯酶基因后通過(guò)PCR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，該過(guò)程需要的原料是

脫氧核苷酸

脫氧核苷酸

；設(shè)計(jì)引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的

3′

3′

（填3′端或5′端）開(kāi)始連接脫氧核苷酸。為方便構(gòu)建得組質(zhì)粒，需要在引物的5′端設(shè)計(jì)

限制

限制

酶的識(shí)別序列。目的基因的序列如圖乙所示，應(yīng)選擇引物

①和③

①和③

（填數(shù)字）。（①-④中前3個(gè)加粗堿基表示保護(hù)堿基。）
①5′-CCGATGCTTGATATGCCAATC-3′
②3′-CCGATGCTTGATATGCCAATC-5′
③5′-CCGCTAGTCGAACACAAGAAG-3′
④3′-CCGCTAGTCGAACACAAGAAG-5′
（3）將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒用限制酶酶切，酶切產(chǎn)物純化后，用DNA連接酶連接，此酶按來(lái)源不同有兩類(lèi)，即

T4

T4

DNA連接酶和

E.coli

E.coli

DNA連接酶。連接的產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌前需

Ca²⁺

Ca²⁺

處理大腸桿菌，使其處于感受態(tài)。