人呼吸道合胞病毒（HRSV）是一種單鏈RNA病毒，如圖是構建人呼吸道合胞病毒基因組載體的示意圖，下表是相關限制酶的識別序列及切割位點，請回答：

限制酶	BclⅠ	EcoRⅠ	XbaⅠ	Sau3AⅠ	BamHⅠ
識別序列及切割位點	T↓GATCA	G↓AATTC	T↓CTAOA	↓GATC	G↓GATCC

（1）HRSV的基因組為-RNA，入侵細胞后在

RNA復制酶

RNA復制酶

的催化下合成+RNA．
（2）過程②設計引物時在兩種引物的5′端分別添加

XbaⅠ

XbaⅠ

、

Sau3AⅠ

Sau3AⅠ

酶的識別序列。過程③需要用

XbaⅠ

XbaⅠ

、

Sau3AⅠ

Sau3AⅠ

酶切割質粒A。
（3）過程④將質粒B導入大腸桿菌，有利于

擴增重組DNA分子，用于下一步的抗性檢測

擴增重組DNA分子，用于下一步的抗性檢測

，需要用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理大腸桿菌。
（4）為制備減毒突變株，科研人員將單個突變堿基引入HRSV基因組cDNA質?？寺≈?，流程如圖。已知在細菌體內合成的DNA分子有甲基化修飾，通過PCR擴增的DNA鏈無甲基化修飾。

①DpnⅠ識別甲基化的GATC四個堿基序列，因此其能將

原來的a、b鏈

原來的a、b鏈

水解消化掉。在大腸桿菌細胞內完成缺刻修復需要

DNA連接

DNA連接

酶。
②已知質粒B為a個，經過程①擴增15個循環(huán)，需要突變引物

15a

15a

個，將過程②形成的產物全部轉入大腸桿菌后復制n輪，得到雙鏈突變的DNA

15a×2^n-1

15a×2^n-1

個。