基因工程中的載體分為克隆載體和表達(dá)載體?？寺≥d體用來(lái)克隆和擴(kuò)增DNA片段，而表達(dá)載體是使外源基因在宿主細(xì)胞中有效表達(dá)。胡蘿卜抗凍蛋白基因（afp）是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)植物抗凍蛋白基因，對(duì)于植物抗凍基因工程具有非常重要的意義。下表為幾種限制酶的識(shí)別序列及酶切位點(diǎn)，如圖表示構(gòu)建afp基因表達(dá)載體的過(guò)程，其中PUCm-T、PBI121為人工改造后的質(zhì)粒，LacZ基因可用于重組質(zhì)粒的篩選。

限制酶	識(shí)別序列
BamHⅠ	5′-G↓GATCC-3′
EcoRⅠ	5′-G↓AATTC-3′
PstⅠ	5′-C↓TGCAG-3′
XbaⅠ	5′-T↓CTAGA-3′
SmaⅠ	5′-CCC↓GGG-3′

 （1）通過(guò)PCR可獲得大量的afp基因，PCR 的原理是

DNA半保留復(fù)制

DNA半保留復(fù)制

，擴(kuò)增時(shí)需選用的引物為

afp的多個(gè)A聚合的尾與PUCm-T尾端多個(gè)聚合的T可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)相連

afp的多個(gè)A聚合的尾與PUCm-T尾端多個(gè)聚合的T可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)相連

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（2）PCR產(chǎn)物往往在引物端含有多個(gè)人聚合的尾，而PUCm T尾端由多個(gè)T聚合，所以在構(gòu)建克隆載體時(shí)不需要用限制酶處理afp和PUCm-T，理由是

引物1和引物3

引物1和引物3

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（3）LacZ基因編碼的β-半乳糖背酶可催化乳糖的水解，培養(yǎng)基中添加物質(zhì)IPTG可誘導(dǎo)LacZ基因的表達(dá)，將培養(yǎng)基中的白色物質(zhì)X-gal轉(zhuǎn)化為藍(lán)色物質(zhì)。據(jù)圖分析，成功導(dǎo)入克隆載體的大腸桿菌菌落呈

白色

白色

（填“白色”或“藍(lán)色”），理由是

成功導(dǎo)入克隆載體的大腸桿菌中，afp插入LacZ內(nèi)部，破壞了LacZ基因的結(jié)構(gòu)，無(wú)法表達(dá)β-半乳糖苷酶，無(wú)法將培養(yǎng)基中的X-gal轉(zhuǎn)化為藍(lán)色物質(zhì)

成功導(dǎo)入克隆載體的大腸桿菌中，afp插入LacZ內(nèi)部，破壞了LacZ基因的結(jié)構(gòu)，無(wú)法表達(dá)β-半乳糖苷酶，無(wú)法將培養(yǎng)基中的X-gal轉(zhuǎn)化為藍(lán)色物質(zhì)

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（4）提取大腸桿菌中的克隆載體后，先用EcoRⅠ處理克隆載體，再將兩端形成的黏性末端補(bǔ)平，補(bǔ)平后再用XbaⅠ處理，得到了一端平末端，一端黏性末端的afp,同時(shí)選用

XbaⅠ和SmaⅠ

XbaⅠ和SmaⅠ

 （從表中選擇） 處理PBI121質(zhì)粒，然后用DNA連接酶將PBI121與alp進(jìn)行連接，構(gòu)成afp基因表達(dá)載體。在此過(guò)程中，使afp的兩端形成不同的末端的意義是

可以防止afp倒接，防止afp自身環(huán)化

可以防止afp倒接，防止afp自身環(huán)化

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