三氯生是一種廣譜抑菌物質(zhì)，可用于基因工程中篩選含目的基因的受體菌。某科研團(tuán)隊(duì)通過(guò)先篩選出一種對(duì)三氯生抗性較強(qiáng)的重組質(zhì)粒（如圖1），再將可以受溫度調(diào)控的基因插入該質(zhì)粒上，構(gòu)建了溫度調(diào)控表達(dá)質(zhì)粒。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）利用從細(xì)菌中提取的DNA通過(guò)PCR技術(shù)獲取fabVA基因（或fabVB基因）時(shí)，至少需經(jīng)過(guò)

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次擴(kuò)增可獲得8個(gè)雙鏈等長(zhǎng)的目的基因。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，微量離心管中需加入的物質(zhì)有：模板、引物、原料、

緩沖液、Taq酶（耐高溫的DNA聚合酶）

緩沖液、Taq酶（耐高溫的DNA聚合酶）

。圖2為PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，操作較理想的泳道有

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條。
（2）圖1中，步驟Ⅰ需要的工具酶是

限制酶和DNA連接酶

限制酶和DNA連接酶

；步驟Ⅱ常用的方法是用Ca²⁺處理使細(xì)菌成為

感受態(tài)

感受態(tài)

；為達(dá)到步驟Ⅲ預(yù)期的篩選目的，所用物質(zhì)X最可能為

三氯生

三氯生

。
（3）為獲得一種增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)三氯生的抵抗作用效果較好的重組質(zhì)粒，將含有不同質(zhì)粒的大腸桿菌分別接種到相應(yīng)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)一段時(shí)間后，結(jié)果如圖3，則適宜選作構(gòu)建溫度調(diào)控表達(dá)質(zhì)粒的是

（重組質(zhì)粒）pEA

（重組質(zhì)粒）pEA

。
（4）科研工作者對(duì)上述選出的質(zhì)粒進(jìn)行改造，獲得了圖4所示質(zhì)粒。其中S₁和S₂是啟動(dòng)子，P₁和P₂是終止子。H基因在高溫下會(huì)抑制S₁，L基因在低溫下會(huì)抑制S₂。
①如果將lacZ基因和GFP（綠色熒光蛋白）基因插入圖4質(zhì)粒中，且使得低溫下只表達(dá)GFP基因，高溫下只表達(dá)lacZ基因，則lacZ基因插在

啟動(dòng)子S₂和終止子P₂（S₂和P₂）

啟動(dòng)子S₂和終止子P₂（S₂和P₂）

之間，而GFP基因的插入位置及注意點(diǎn)是

插在啟動(dòng)子S₁和終止子P₁（插在S₁和P₁）之間，但不破壞H基因和L基因

插在啟動(dòng)子S₁和終止子P₁（插在S₁和P₁）之間，但不破壞H基因和L基因

。
②若以大腸桿菌為受體細(xì)胞，篩選上述①中插入GFP基因成功的受體細(xì)胞的依據(jù)是：大腸桿菌能在含

三氯生

三氯生

的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，且

低溫下有綠色熒光，高溫下無(wú)綠色熒光

低溫下有綠色熒光，高溫下無(wú)綠色熒光

。