圖甲為構(gòu)建重組質(zhì)粒過程中的三種備選質(zhì)粒，其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環(huán)素抗性基因。圖乙為培育轉(zhuǎn)AFPs基因（抗凍基因）番茄的示意圖，外源DNA和質(zhì)粒上均標(biāo)出了酶切位點(diǎn)及相關(guān)抗性基因，請回答下列問題。

（1）圖甲中通常選用質(zhì)粒C構(gòu)建重組質(zhì)粒，而不選用質(zhì)粒A或質(zhì)粒B的原因分別是

質(zhì)粒A中沒有標(biāo)記基因，質(zhì)粒B的復(fù)制原點(diǎn)中含有HindⅢ酶切位點(diǎn)

質(zhì)粒A中沒有標(biāo)記基因，質(zhì)粒B的復(fù)制原點(diǎn)中含有HindⅢ酶切位點(diǎn)

。
（2）據(jù)圖乙分析，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質(zhì)粒，應(yīng)優(yōu)先選用限制酶

BamHⅠ和HindⅢ

BamHⅠ和HindⅢ

切割目的基因和質(zhì)粒。
（3）通過PCR技術(shù)獲取目的基因時(shí)需設(shè)計(jì)

2

2

種引物；從cDNA文庫中獲得的目的基因

不含有

不含有

（填“含有”或“不含有”）啟動(dòng)子和終止子。
（4）在構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中常把兩個(gè)啟動(dòng)子串聯(lián)在一起形成雙啟動(dòng)子，加在目的基因上游。雙啟動(dòng)子的作用可能是

保證目的基因的高效轉(zhuǎn)錄（高效表達(dá)）

保證目的基因的高效轉(zhuǎn)錄（高效表達(dá)）

。
（5）圖乙農(nóng)桿菌中的質(zhì)粒應(yīng)含有T-DNA，其作用是

攜帶目的基因進(jìn)入番茄細(xì)胞并整合到番茄細(xì)胞的染色體DNA

攜帶目的基因進(jìn)入番茄細(xì)胞并整合到番茄細(xì)胞的染色體DNA

。若要獲得抗凍能力更強(qiáng)的抗凍番茄，可以對AFPs基因進(jìn)行改造，最終得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，該過程需用到

蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)

工程。
（6）為使改造后的AFPs基因能夠表達(dá)，人工設(shè)計(jì)質(zhì)粒D并對它的多個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行研究。若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨(dú)切割質(zhì)粒D，均獲得一條長鏈，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時(shí)切割，則獲得2個(gè)500bp和1個(gè)2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時(shí)切割，則獲得2個(gè)250bp和1個(gè)3166bp片段。若以HindⅢ酶切割位點(diǎn)為計(jì)算起點(diǎn)，則KpnⅠ酶切割位點(diǎn)與HindⅢ酶切割位點(diǎn)最短長度為

750bp

750bp

，EcoRⅠ酶的兩個(gè)切割位點(diǎn)與HindⅢ切割位點(diǎn)的最短距離為

500bp

500bp

。