采用IRES序列連接AFP基因（甲胎蛋白基因）和IL-2基因（白細胞介素-2基因）構(gòu)建雙基因共表達重組載體，能夠利用同一載體同時表達出人甲胎蛋白以及人白細胞介素-2。該重組載體可用于肝癌的基因免疫治療，既能發(fā)揮細胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用，又能靶向性地針對肝癌產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)。如圖為雙基因共表達重組載體的結(jié)構(gòu)示意圖?；卮鹣铝袉栴}：

（1）從肝癌HepG₂細胞中獲取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，用含有BglⅡ和EcoRⅠ酶切位點序列的AFP特異性引物進行PCR擴增，得到含有BglⅡ和EcoRⅠ酶切位點的AFP基因片段。
①AFP基因PCR反應(yīng)體系中需要加入模板、酶、引物和維持pH穩(wěn)定的

緩沖液

緩沖液

，還需加入

Mg²⁺

Mg²⁺

以激活耐高溫DNA聚合酶的活性。
②將限制酶BglⅡ、EcoRⅠ的識別序列接在AFP引物的5'端，原因是

使引物的3'端與模板鏈嚴格互補配對，且不影響子鏈的延伸

使引物的3'端與模板鏈嚴格互補配對，且不影響子鏈的延伸

，上游引物與下游引物四種堿基的堿基比相當，若上游引物核苷酸數(shù)目較多時，這一差異會直接影響PCR中的

復(fù)性

復(fù)性

步驟。
（2）用限制酶BglⅡ、EcoRⅠ分別酶切PIRES₂-EGFP質(zhì)粒得到AFP基因片段，并使用T₄DNA連接酶進行連接，得到PIRES_2-AFP-EGFP重組載體；從CIK細胞獲取cDNA作為模板，用含有BstXⅠ和NotⅠ酶切黏性末端的IL-2特異性引物進行PCR擴增，得到的IL-2基因與酶切后PIRES₂-AFP-EGFP重組載體混合，得到PIRES₂-AFP-IL-2重組載體。上述表達載體的構(gòu)建過程中，獲取目的基因及切割質(zhì)粒均使用兩種限制酶的目的是

防止目的基因及質(zhì)粒自身環(huán)化；保證目的基因和載體之間的定向、準確連接（防止目的基因與載體反向連接）

防止目的基因及質(zhì)粒自身環(huán)化；保證目的基因和載體之間的定向、準確連接（防止目的基因與載體反向連接）

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（3）IRES是mRNA5'端具有的一段較短的RNA序列，這類RNA序列能折疊成類似于起始tRNA的結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)核糖體與RNA結(jié)合，開啟蛋白質(zhì)翻譯過程。與兩個基因直接連接形成融合基因相比，兩個基因之間插入IRES序列的意義是

利用一種mRNA可連續(xù)翻譯出兩種蛋白質(zhì)

利用一種mRNA可連續(xù)翻譯出兩種蛋白質(zhì)

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（4）人的AFP基因和IL-2基因能在奶牛膀胱上皮細胞中表達的原因是

生物界共用一套遺傳密碼

生物界共用一套遺傳密碼

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