菘藍(lán)是常用中藥板藍(lán)根和大青葉的主要基原植物，有清熱解毒、涼血利咽的功效，可防治病毒性感染。在各地廣為栽培，但常因除草劑的侵害，造成質(zhì)量和產(chǎn)量下降。鏈霉菌中的bar基因序列未知，其編碼的乙酰轉(zhuǎn)移酶能使除草劑的活性成分草丁騰失活，擬利用基因工程技術(shù)將bar基因?qū)胼克{(lán)中，以獲得抗除草劑的菘藍(lán)植株?；卮鹣铝袉栴}：
（1）為獲取bar基因，需將鏈霉菌基因組DNA借助載體、微生物等所形成的

基因（組）文庫

基因（組）文庫

中的所有基因進(jìn)行表達(dá)，并用乙酰轉(zhuǎn)移酶為抗原所制備出的靈敏度高的

單克隆抗體

單克隆抗體

來檢測表達(dá)產(chǎn)物。在該制備過程中，需從已免疫的小鼠

脾臟

脾臟

（填一器官名稱）中提取B淋巴細(xì)胞，并與骨髓瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，過程中需采用

聚乙二醇、滅活的（仙臺）病毒、電刺激、離心

聚乙二醇、滅活的（仙臺）病毒、電刺激、離心

等方法誘導(dǎo)其融合（答出2點即可）。
（2）如圖1和圖2為各種限制酶的識別序列在質(zhì)粒、含目的基因的DNA片段上的分布情況。在構(gòu)建表達(dá)載體時，為防止DNA片段反向拼接和自身環(huán)化，需用限制酶

HindⅢ、EcoRⅠ

HindⅢ、EcoRⅠ

（填BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、SmaⅠ中的一種或幾種）同時處理Ti質(zhì)粒和含目的基因的DNA片段，并用

DNA連接酶

DNA連接酶

進(jìn)行連接。為提高形成重組DNA的成功率，除上述處理外，還可以采用改變溫度和pH等環(huán)境條件、提高DNA連接酶的濃度、提高目的基因的濃度、

提高DNA連接酶的活性、提高質(zhì)粒的濃度、改變質(zhì)粒和目的基因的比例等

提高DNA連接酶的活性、提高質(zhì)粒的濃度、改變質(zhì)粒和目的基因的比例等

（寫出兩種方法即可）
?
（3）將bar基因?qū)胧荏w細(xì)胞。轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌時應(yīng)添加

CaCl₂溶液

CaCl₂溶液

以利于重組質(zhì)粒進(jìn)入農(nóng)桿菌細(xì)胞；利用含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染稱藍(lán)的葉片時，Ti質(zhì)粒上的

T-DNA

T-DNA

可以攜帶bar基因整合到菘藍(lán)葉片細(xì)胞的染色體DNA上；將葉片轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入抗生素的作用是

殺滅農(nóng)桿菌

殺滅農(nóng)桿菌

，再轉(zhuǎn)移到含有

草丁膦

草丁膦

培養(yǎng)基上，篩選出已經(jīng)轉(zhuǎn)化的菘藍(lán)細(xì)胞。
（4）取被侵染的菘藍(lán)葉片組織接種到MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過

器官發(fā)生途徑

器官發(fā)生途徑

或體細(xì)胞胚發(fā)生途徑形成轉(zhuǎn)基因植株，該過程中利用了

植物細(xì)胞的全能性

植物細(xì)胞的全能性

原理。為檢驗bar基因是否表達(dá)，在分子水平上可用

核酸探針

核酸探針

來檢測其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。