某小組為研究真菌基因m的功能，構(gòu)建了融合表達(dá)蛋白M和tag標(biāo)簽的質(zhì)粒，請結(jié)合實驗流程回答下列問題：

（1）目的基因的擴(kuò)增：
①提取真菌細(xì)胞

RNA

RNA

，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)一步獲得基因m片段。
②為了獲得融合tag標(biāo)簽的蛋白M，設(shè)計引物P2時，不能包含基因m終止密碼子的編碼序列，否則將導(dǎo)致

蛋白M上不含tag標(biāo)簽

蛋白M上不含tag標(biāo)簽

。
③熱啟動PCR可提高擴(kuò)增效率，方法之一是：先將除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加熱到80℃以上再混入酶，然后直接從94℃開始PCR擴(kuò)增，下列敘述正確的有

BC

BC

。
A．Taq酶最適催化溫度范圍為50～60℃
B．與常規(guī)PCR相比，熱啟動PCR可減少反應(yīng)起始時引物錯配形成的產(chǎn)物
C．兩條子鏈的合成一定都是從5′端向3′端延伸
D．PCR產(chǎn)物DNA堿基序列的特異性體現(xiàn)了Taq酶的特異性
（2）重組質(zhì)粒的構(gòu)建：
①將SmaⅠ切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進(jìn)

黏性末端堿基配對

黏性末端堿基配對

，形成A-m結(jié)合體。將A-m結(jié)合體導(dǎo)入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及

DNA連接

DNA連接

酶等，完成質(zhì)粒的環(huán)化。
②若正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒A-m仍能被SmaⅠ切開，則SmaⅠ的酶切位點可能在

基因m的連接處、基因m的內(nèi)部

基因m的連接處、基因m的內(nèi)部

。
（3）融合蛋白的表達(dá)：
①用含有尿嘧啶的培養(yǎng)基培養(yǎng)URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導(dǎo)入質(zhì)粒A-m,然后涂布于無尿嘧啶的培養(yǎng)基上，篩選獲得目的菌株，其機(jī)理是

受體菌在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上無法生長，導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌含有URA3基因可以長成菌落

受體菌在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上無法生長，導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌含有URA3基因可以長成菌落

。
②若通過抗原—抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標(biāo)簽，說明

融合基因表達(dá)（或融合基因正確解碼）

融合基因表達(dá)（或融合基因正確解碼）

，后續(xù)實驗可借助tag標(biāo)簽進(jìn)行蛋白M的分離純化。