膠原蛋白在維持器官、組織、細(xì)胞等方面發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，傳統(tǒng)提取方法得到的膠原蛋白成分復(fù)雜，還可能攜帶動物病毒等?？茖W(xué)家將合成膠原蛋白的基因kit導(dǎo)入大腸桿菌構(gòu)建基因工程菌，過程如圖1所示。請據(jù)圖回答下列問題：

（1）圖中①過程需要使用

逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄

酶，②過程需要用到的酶有

限制酶

限制酶

和

DNA連接酶

DNA連接酶

，前者可以切斷兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
（2）用圖中方法得到的kit基因較少，可以采用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，已知kit基因的部分序列如下：
5'-CGGG ATCCALLAGAATTCCG-3'
3'-GCCCTAGGTLLTCTTAAGGC-5'
根據(jù)上述序列設(shè)計(jì)引物為

BC

BC

（填字母），以

BamHⅠ和EcoRⅠ

BamHⅠ和EcoRⅠ

（填限制酶）進(jìn)行雙酶切kit基因與質(zhì)粒pET-28a（+），為了實(shí)現(xiàn)目的基因與運(yùn)載體的連接，則需要在引物的

5’

5’

端添加限制酶識別序列。
A．5'-GCCCTAGGT-3'B．5'-CGGAATTCT-3'
C．5'-CGGGATCCA-3'D．5'-GCCTTAAGA-3'
（3）為了使重組質(zhì)粒更易進(jìn)入大腸桿菌，可以用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理大腸桿菌，若要檢測kit基因是否在大腸桿菌體內(nèi)發(fā)揮作用，首先需要檢測大腸桿菌的

RNA

RNA

（選填“DNA”或“RNA”）。
（4）雙酶切kit基因，與質(zhì)粒pET-28a（+）長度為170bp片段進(jìn)行置換，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a（+）-kit,上述兩種質(zhì)粒在HindⅢ酶切后片段長度如下表所示，

質(zhì)粒類型	pET-28a（+）	pET-28a（+）-kit
HindⅢ酶切片段	1000bp、2550bp	1000bp、2000bp、700bp

則kit基因長度為

320bp

320bp

，由此判定kit基因上有2個HindⅢ酶切位點(diǎn)，原因是

pET-28a（+）原有的兩個HindⅢ位點(diǎn)被目的基因置換走一個后，得到環(huán)狀的pET-28a（+）-kit仍然被HindⅢ限制酶切割成3段

pET-28a（+）原有的兩個HindⅢ位點(diǎn)被目的基因置換走一個后，得到環(huán)狀的pET-28a（+）-kit仍然被HindⅢ限制酶切割成3段

。
（5）菌液PCR是直接以菌體熱解后的DNA為模板、以目基因兩端序列為引物進(jìn)行擴(kuò)增的方法，根據(jù)凝膠電泳結(jié)果可初步鑒定菌落是否含有目的基因。對構(gòu)建的基因工程菌進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，根據(jù)初步驗(yàn)證的結(jié)果提取大腸桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切再驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示。分析可知，基因工程菌的構(gòu)建

是

是

（選填“是”或“否”）成功，原因是

菌落PCR與質(zhì)粒雙酶切均獲得大小約為320bp的基因片段

菌落PCR與質(zhì)粒雙酶切均獲得大小約為320bp的基因片段

。