Cre/loxP酶系統(tǒng)是在基因或染色體水平上對生物基因進行遺傳改造的一種技術(shù)，可以在DNA的特定位點上執(zhí)行堿基序列的刪除、插入以及重組等，從而實現(xiàn)基因的定點編輯。

（1）圖1是利用Cre/loxP酶系統(tǒng)敲除基因的過程。loxP序列具有方向性，由中間的間隔序列和兩側(cè)的反向重復(fù)序列組成。當某一條DNA片段上待敲除基因的兩端存在同向loxP序列時，Cre酶識別并結(jié)合到loxP序列的反向重復(fù)序列區(qū)。兩個loxP序列的間隔序列被Cre酶定點切開，4個黏性末端序列交錯兩兩連接，其中待敲除基因兩端的序列進行連接，連接時形成的化學(xué)鍵是

磷酸二酯鍵

磷酸二酯鍵

，敲除的基因片段會形成

環(huán)狀

環(huán)狀

（填“線狀”或“環(huán)狀”）結(jié)構(gòu)。
（2）圖2是利用Cre/loxP酶系統(tǒng)構(gòu)建融合基因的過程。首先要用PCR對Bt基因和Bar基因分別擴增，以獲得所需要的DNA片段，然后對連接后的DNA片段用Cre/loxP酶系統(tǒng)處理獲得Bt-Bar融合基因片段。在用PCR1擴增Bt基因時，所用的2種引物的結(jié)合位置在

Bt的兩種引物分別在啟動子外側(cè)和終止子內(nèi)側(cè)

Bt的兩種引物分別在啟動子外側(cè)和終止子內(nèi)側(cè)

；又有研究表明，大多數(shù)限制酶對裸露的位點不能識別切割，因此必須對識別序列5′末端進行修飾并加上一個至幾個保護堿基，如GGG。由此推測，對Bar基因引物5′端序列的要求是

引物的5'端均要連接上loxP序列，并在末端加上保護堿基序列（GGG）

引物的5'端均要連接上loxP序列，并在末端加上保護堿基序列（GGG）

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（3）圖3是用Cre/loxP酶系統(tǒng)敲除轉(zhuǎn)基因煙草細胞內(nèi)Bar基因的部分過程。已知圖中的啟動子和終止子可在煙草細胞中正常發(fā)揮作用，Cre酶基因在環(huán)境中存在Tam化學(xué)物質(zhì)時才能激活表達。重組Ti質(zhì)粒中的Bar基因作為基因表達載體中的

標記基因

標記基因

可對轉(zhuǎn)化后的煙草細胞進行篩選。進行圖3所示敲除后，DNA片段1中的Bt基因不能正確表達，據(jù)圖分析，原因是

缺少Bar的終止子

缺少Bar的終止子

；若不對融合基因中的Bar基因進行敲除處理，僅在翻譯水平上不讓Bar基因表達，請利用Cre/loxP酶系統(tǒng)提出解決方案

利用Cre/loxP酶系統(tǒng)在Bt基因和Bar基因之間插入終止密碼子對應(yīng)的DNA序列

利用Cre/loxP酶系統(tǒng)在Bt基因和Bar基因之間插入終止密碼子對應(yīng)的DNA序列

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（4）圖4是經(jīng)過修飾后的轉(zhuǎn)基因煙草細胞內(nèi)的融合基因所在片段及相關(guān)引物的結(jié)合位點。為檢測Bar基因是否被成功敲除同時未影響B(tài)t基因的正常表達，可用PCR技術(shù)進行鑒定：
實驗組：首先提取在有Tam環(huán)境下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因煙草細胞質(zhì)中的總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后加入引物1和引物2進行PCR擴增，再進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察有無Bt基因和Bar基因的條帶。
對照組：用未進行敲除處理的轉(zhuǎn)基因煙草細胞，其余同實驗組。
若實驗組敲除成功，則實驗組和對照組的電泳結(jié)果分別為

實驗組沒有條帶，對照組有一條bt-bar融合基因條帶

實驗組沒有條帶，對照組有一條bt-bar融合基因條帶

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