腸道病毒EV71是RNA病毒,其表面蛋白為VP1~VP4,分別由V1~V4基因控制。為研究VP1~VP4的抗原性,從中篩選出EV71的疫苗抗原,研究人員利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)了上述4種蛋白質(zhì)。如圖是制備V1基因表達(dá)載體的過程示意圖,請回答下列問題:
gus:控制合成的酶使β-葡萄糖苷酸水解為藍(lán)色物質(zhì)
Kan:卡那霉素抗性基因
(1)以RNA為模板,通過4組RT-PCR可分別獲取V1~V4基因(DNA)。RT-PCR所需要的酶有 逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶,該過程中子鏈延伸時所需的能量較為特殊,一般來自 dNTPdNTP。
(2)為方便目的基因與質(zhì)粒的連接,通常將限制酶的切點設(shè)計在引物上。引物一般為單鏈DNA,新合成子鏈的延伸方向為5′→3′。PCR獲取V1基因時,10引物中限制酶切點的堿基序列應(yīng)設(shè)計為上游引物3′…GGATCCGGATCC…5′,下游引物3′…CTCGAGCTCGAG…5′。
(3)用相關(guān)限制酶處理質(zhì)粒和V1基因后,再與 DNA連接DNA連接酶混合,加入大腸桿菌溫育。一段時間后,將菌液涂布在含有 β—葡萄糖苷酸β—葡萄糖苷酸和 卡那霉素卡那霉素的平板上,經(jīng)培養(yǎng),在平板上長出白色和藍(lán)色兩種菌落,其中 白色白色菌落含有V1基因表達(dá)載體,判斷依據(jù)是 構(gòu)建目的基因表達(dá)載體時切除了gus含基因,在含β—葡萄糖苷酸的培養(yǎng)基上,含重組V1基因質(zhì)粒的大腸桿菌不顯藍(lán)色構(gòu)建目的基因表達(dá)載體時切除了gus含基因,在含β—葡萄糖苷酸的培養(yǎng)基上,含重組V1基因質(zhì)粒的大腸桿菌不顯藍(lán)色。
【考點】DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定.
【答案】逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶;dNTP;GGATCC;CTCGAG;DNA連接;β—葡萄糖苷酸;卡那霉素;白色;構(gòu)建目的基因表達(dá)載體時切除了gus含基因,在含β—葡萄糖苷酸的培養(yǎng)基上,含重組V1基因質(zhì)粒的大腸桿菌不顯藍(lán)色
【解答】
【點評】
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限制酶 BclⅠ NotⅠ XbaⅠ San3AⅠ 識別序列及切割位點 T↓GATCA GC↓GGCCGC T↓CTAGA ↓GATC
a 5'-GCTCTAGAATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC
b 5'-GTTGCGGCCGCTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC
c 5'-GCGATCATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC
d 5'-GTTTGATCACTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC
(2)過程②將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌的目的是
(3)若用Sau3AⅠ和XbaⅠ完全酶切質(zhì)粒C后電泳,請在答題紙相應(yīng)位置畫出可能得到的電泳條帶。
(4)科研中常用呤霉素對真核細(xì)胞進(jìn)行篩選,一般選擇最低致死濃度的前一個濃度作為篩選濃度的原因是:既可以讓大部分沒有抗性的細(xì)胞死亡又不會讓
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