某動(dòng)物肝臟合成的P蛋白具有抑制癌細(xì)胞增殖的作用，為建立在大腸桿菌中高效表達(dá)的工程菌，研究者從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了相關(guān)信息即該蛋白的基因編碼序列（簡(jiǎn)稱P基因），大小為1.5kb,請(qǐng)補(bǔ)充完善以下實(shí)驗(yàn)思路：
（1）為獲取P基因，提取該動(dòng)物

肝臟細(xì)胞

肝臟細(xì)胞

（癌細(xì)胞、肝細(xì)胞）的

總RNA

總RNA

，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化得到cDNA，將其作為PCR反應(yīng)的模板，并設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物來(lái)擴(kuò)增P基因。
（2）圖甲為所選用的載體示意圖，其中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見(jiàn)表。為了實(shí)現(xiàn)目的基因和運(yùn)載體的

定向連接

定向連接

，選擇

PvitII和EcoRⅠ

PvitII和EcoRⅠ

限制酶的識(shí)別序列來(lái)切割。已知P基因序列內(nèi)部和兩端不含圖甲中限制酶的識(shí)別序列，在PCR擴(kuò)增的P基因，兩種引物的

5′

5′

端分別引入上述兩種限制酶的識(shí)別序列。再將這兩種限制酶切割的P基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用

T4DNA連接酶

T4DNA連接酶

（E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶），在目的基因和運(yùn)載體片段間形成

磷酸二酯鍵

磷酸二酯鍵

。
表：相關(guān)限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)

名稱	識(shí)別序列及切割位點(diǎn)	名稱	識(shí)別序列及切割位點(diǎn)
HindⅢ	↓AAGCTTTTCGAA↑	EcoRⅠ	↓GAATTCCTTAAG↑
PvitⅡ	↓CAGCTGGTCGAC↑	PstⅠ	↓CTGCAGGACGTC↑
KpnⅠ	↓GGTACCCCATGG↑	BamHⅠ	↓GGATCCCCTAGG↑

（注：箭頭表示切割位點(diǎn)）
?
（3）轉(zhuǎn)化前需用

CaCl₂溶液或鈣離子溶液

CaCl₂溶液或鈣離子溶液

處理大腸桿菌細(xì)胞，以提高轉(zhuǎn)化效率。基因工程的受體細(xì)胞若是植物細(xì)胞常采用

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

。
（4）將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含

氨芐青霉素

氨芐青霉素

的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取菌落（分別編號(hào)為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)所選用的限制酶進(jìn)行酶切，徹底酶切產(chǎn)物需通過(guò)

瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳

分離，結(jié)果如圖乙，

2

2

號(hào)菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。