某種地中海貧血（TDT）是嚴(yán)重的單基因病，嚴(yán)重時可能危及生命。人類γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點，該位點結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變該結(jié)合位點的序列，解除對γ基因表達(dá)的抑制，可對TDT患者實行基因治療。研究人員擴增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，可以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。分析回答：

（1）圖中啟動子是

RNA聚合酶

RNA聚合酶

識別和結(jié)合位點，綠色熒光蛋白基因作為

標(biāo)記基因

標(biāo)記基因

。
（2）PCR擴增γ基因上游不同DNA片段的原理是

DNA雙鏈復(fù)制

DNA雙鏈復(fù)制

，為使PCR反應(yīng)體系中的模板解鏈為單鏈，需要滿足的條件是

加熱（至90-95℃）

加熱（至90-95℃）

。
（3）將擴增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)綠色熒光蛋白基因表達(dá)，需要在引物末端添加限制酶識別序列。據(jù)圖可知，在R末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶應(yīng)為

EcoRⅠ

EcoRⅠ

。實驗中R等引物的作用是

使DNA聚合酶（Taq酶）從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸

使DNA聚合酶（Taq酶）從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸

。
（4）從產(chǎn)物擴增到載體構(gòu)建完成的整個過程中，除限制酶外，還必須用到的工具酶有DNA連接酶和

耐熱的DNA聚合酶

耐熱的DNA聚合酶

，其中前者催化形成的化學(xué)鍵是

磷酸二酯鍵

磷酸二酯鍵

。
（5）將構(gòu)建好的載體成功轉(zhuǎn)化至除去BCL11A基因的受體細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含F(xiàn)1～F6與R擴增產(chǎn)物的受體細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。向培養(yǎng)液中添加適量的雄激素，含F(xiàn)1～F4與R擴增產(chǎn)物的受體細(xì)胞熒光消失，而含F(xiàn)5～F6與R擴增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游的調(diào)控序列上與引物所對應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點序列，據(jù)此結(jié)果可推測，BCL11A蛋白結(jié)合位點位于

引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上

引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上

。