神經(jīng)生長因子（NGF）對神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化有重要作用，對非神經(jīng)性細(xì)胞的生長和活性有輔助作用，對神經(jīng)性和非神經(jīng)性疾病都有良好的潛在治療作用。科研人員通過轉(zhuǎn)基因方法制備能在腮腺中特異性表達(dá)人源神經(jīng)生長因子（hNGF）的轉(zhuǎn)基因豬，并采集該轉(zhuǎn)基因豬分泌的唾液，分離純化hNGF用于人類神經(jīng)性疾病的治療?；卮鹣铝袉栴}：
（1）步驟一：將hNGF基因序列替換位于載體XhoⅠ和NotⅠ酶切位點之間的序列，構(gòu)建含人源NGF的基因表達(dá)載體。該步驟中選擇XhoⅠ和NotⅠ兩種限制酶的優(yōu)點是

避免切制后目的基因和質(zhì)粒發(fā)生自身環(huán)化，且能保證正確連接

避免切制后目的基因和質(zhì)粒發(fā)生自身環(huán)化，且能保證正確連接

，在hNGF基因的兩端也必須含有XhoⅠ和NotⅠ酶識別的序列，添加的方法是

在對hNGF基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，將兩種限制酶的識別序列合成在兩種引物中

在對hNGF基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，將兩種限制酶的識別序列合成在兩種引物中

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（2）步驟二：將基因表達(dá)載體導(dǎo)入豬胎兒成纖維細(xì)胞。該步驟使用的方法是

顯微注射法

顯微注射法

，目的是

使hNGF基因進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中維持穩(wěn)定和表達(dá)

使hNGF基因進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中維持穩(wěn)定和表達(dá)

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（3）步驟三：重構(gòu)胚的構(gòu)建。篩選成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的豬胎兒成纖維細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，該過程中會出現(xiàn)

細(xì)胞貼壁和接觸抑制

細(xì)胞貼壁和接觸抑制

的現(xiàn)象，需要用胰蛋白酶進(jìn)行處理并及時分瓶培養(yǎng)。獲得的細(xì)胞作為核供體注入

去核的豬卵母細(xì)胞

去核的豬卵母細(xì)胞

中。
（4）步驟四：轉(zhuǎn)基因克隆豬的獲得。重構(gòu)胚發(fā)育到

桑葚胚或囊胚

桑葚胚或囊胚

后經(jīng)胚胎移植導(dǎo)入代孕豬子宮內(nèi)，獲得的轉(zhuǎn)基因豬的遺傳物質(zhì)來自

豬成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核、去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和人的hNGF基因

豬成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核、去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和人的hNGF基因

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